白念珠菌MP65和SAP2蛋白原核表达质粒的构建与表达

目的构建以白念珠菌基因MP65和SAP2为目的基因的原核表达质粒,IPTG诱导其表达融合蛋白,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株获取MP65和SAP2基因,分别插入至原核表达载体pGEX-4T-2和pET32a中;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、纯化后,SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR法克隆出全长为1 140 bp的MP65和1 197 bp的SAP2基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-MP65及pET32a-SAP2,可分别表达出66 KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。结论成功获取了白念珠菌基因MP65和SAP2,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;两种蛋白均有免疫原性。

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA,以其为模板采用聚合酶链反应(PCR)法获取SAP2基因,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC和SAP2基因行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶纯化,连接酶切产物,转化TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisC,电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3.1/SAP2重组质粒,该质粒能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。

白色念珠菌sap2基因真核表达质粒的构建及免疫原性研究

目的构建以白色念珠菌SAP2蛋白编码基因sap2为目的基因的真核重组表达质粒,并对其免疫原性进行分析。方法RT-PCR法自白色念珠菌标准菌株ATCC64550中获取sap2基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中,将真核表达经质粒大抽提并定量后免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体产生水平,流式细胞仪检测细胞免疫。结果RT-PCR法克隆出全长为1 197 bp的sap2基因;用构建的pcDNA3.1-SAP2免疫小鼠,能诱导产生效价为1∶1 600的IgG抗体,同时CD4+T和CD8+T细胞百分比增高。结论成功获取了白色念珠菌sap2蛋白基因,真核表达质粒能够诱导动物的体液免疫和细胞免疫。