SB431542和TGF-β_1对甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF基因表达的影响

目的探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和SB431542（TGF-β1受体酶抑制剂）对甲状腺相关性眼病（thyroid-associated ophthalmopathy,TAO）患者眼眶成纤维细胞α平滑肌激动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）基因表达的影响,为TAO眼外肌纤维化的治疗寻找潜在的药物治疗靶点。方法实验分为3组。第1组：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time PCR,RT-PCR）检测不同浓度TGF-β1（0μg·L-1、1μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1）刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后α-SMA及CTGF mRNA的表达情况;第2组：采用RT-PCR检测10μg·L-1 TGF-β1在不同的时间点（0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）刺激TAO患者眼眶成纤维细胞后α-SMA及CTGF mRNA的表达情况;第3组（分为4小组处理）：眼眶成纤维细胞不加任何干预、使用30μmol·L-1SB431542刺激眼眶成纤维细胞、10μg·L-1 TGF-β1单独刺激眼眶成纤维细胞、30μmol·L-1 SB431542联合10μg·L-1 TGF-β1刺激眼眶成纤维细胞（SB431542预先刺激眼眶成纤维细胞1 h,然后再加入TGF-β1）,采用RT-PCR检测α-SMA及CTGF mRNA的表达。结果TGF-β1在一定的浓度范围内（1~10μg·L-1）以剂量依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGF mRNA,随着浓度增加mRNA表达增加,各浓度组（1μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1）与空白对照组（0μg·L-1）相比,差异均有统计学意义（均为P〈0.05）。TGF-β1在一定的时间范围内（0~24 h）以时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA及CTGF mRNA,随着时间延长mRNA表达增加,各时间组（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）与0 h相比,差异均有统计学意义（均为P〈0.05）。10μg·L-1的TGF-β1诱导眼眶成纤维细胞表达α-SMA mRNA在24 h达到峰值,而CTGF mRNA在12 h即可达到峰值。SB431542对眼眶成纤维细胞α-SMA mRNA及CTGF mRNA的表达均有抑制作用。结论一定范围内,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导眼眶成纤维细胞α-SMA及CTGF mRNA的表达,SB431542可抑制其表达。

SB431542对HSC T6细胞Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响

目的:探讨SB431542对肝星状细胞T6(HSC T6)Smad4蛋白细胞内转位及表达的影响.方法:HSCT6细胞贴壁后,在细胞培养瓶中加入SB43154210mol/L培养2h,用免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜观察细胞内Smad4蛋白细胞内转位.将HSCT6细胞分成3组:空白对照组、SB4315421mol/L组、SB43154210mol/L组,培养24h后分别提取细胞浆蛋白及核蛋白,以Western blot法检测Smad4蛋白表达水平变化.结果:SB43154210mol/L作用2h后,未出现Smad4蛋白向细胞核内转位.HSC T6细胞贴壁后被SB4315421mol/L、SB43154210mol/L作用24h后,细胞浆内Smad4蛋白表达量较空白对照组减少,呈剂量依赖型;而细胞核内Smad4蛋白表达量较空白对照组增多.结论:SB431542通过抑制大鼠HSC活化过程中Smad4蛋白在细胞内的核转位,可起到阻断TGF-1/Smad通路的细胞内信号转导的作用.

SB-431542抑制转化生长因子β1诱导的人胚肺成纤维细胞(HLF)细胞外基质的合成

目的研究转化生长因子β1(TGFβ1)的特异性小分子拮抗剂SB 431542在TGFβ1信号系统功能增强的状况下,对人胚肺成纤维细胞(HLF)合成细胞外基质的影响。方法人胚肺成纤维细胞系(HLF)于体外正常培养。用MTT法评价SB 431542对HLF的细胞毒作用;以半定量RTPCR(reverse transcription polymerase chain reaction)法和琼脂糖凝胶电泳法观察细胞外基质(ECM)中主要组成分子I型胶原α1(Col Iα1)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI 1)和纤维粘连素(FN)的变化。结果SB 431542对HLF的LC50(50%lethal concentration)为52μmol.L-1;在TGFβ1(10μg.L-1)诱导下,SB 431542(0.1、0.5、1.0、10μmol.L-1)可剂量依赖性抑制Col Iα1、PAI 1和FN的mRNA在HLF细胞内的转录。结论SB 431542可明显抑制由于肺内TGFβ1信号系统增强而引起的ECM的合成,表明作用于TGFβ1途径的SB 431542或其他小分子化合物可能对防治肺纤维化有效。

瘦素与SB-431542干预大鼠肝星状细胞及其生物学活性的改变

目的研究TGF-β1受体特异性拮抗剂SB-431542干预瘦素对肝星状细胞的生物活性及其相关机制。方法采用RT-PCR法检测α1(I)前胶原mRNA和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的变化;用间接免疫荧光来观察α1(I)前胶原蛋白、α-SMA蛋白的表达。结果瘦素加SB-431542组与瘦素组相比,各指标之间的差异有统计学意义(P<0.05),随浓度的增加,时间的延长,SB-431542对瘦素刺激的HSC-T6增殖纤维化有显著的抑制作用。结论 SB-431542可明显抑制瘦素的生物学活性,可能通过抑制TGF-β1信号系统而使细胞外基质(ECM)的合成减少,从而抑制肝纤维化。

SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响

通过研究转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的特异性小分子拮抗剂SB-431542对梅花鹿鹿茸软骨层细胞增殖的影响,探讨转化生长因子β在鹿茸快速生长中的调节机制。分离培养生长30天的梅花鹿鹿茸软骨层细胞,将传代培养第2代的细胞经不同浓度的SB-431542(0、1、3、5、8、10μmol/L)作用,培养48h后用MTT法测其细胞增殖的变化,并用SPSS软件分析其差异性。结果显示,SB-431542处理组细胞增殖活性都低于对照组(P<0.05),其中浓度为8μmol/L和10μmol/L的SB-431542处理组与对照组相比差异非常显著(P<0.01),随着添加SB-431542浓度的升高,对细胞的生长速度抑制更加明显,试验结果表明,TGF-β对维持梅花鹿鹿茸软骨层细胞的快速增殖有重要作用。

梅花鹿鹿茸间充质层与前成软骨层细胞的培养及SB-431542对其增殖的影响

分离培养梅花鹿鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞,通过研究TGF-β的特异性小分子拮抗剂SB-431542对这两种细胞增殖的影响,探讨TGF-β在鹿茸间充质层细胞和前成软骨层细胞增殖与分化中的调节机制。从生长30天的梅花鹿鹿茸中分离间充质层细胞和前成软骨层细胞,进行体外培养,将传代培养第2代的间充质层细胞和前成软骨层细胞分别在含不同浓度TGF-βⅠ型受体特异性抑制剂SB-431542(0、1、3、5、8、10μmol/L)的培养液中培养,48h后用MTT法测定这两种细胞增殖活性的变化,用SPSS软件对其增殖的差异性进行分析。结果显示,体外培养的鹿茸间充质层细胞呈成纤维细胞样,前成软骨层细胞呈纺锤形或梭形,台盼兰染色显示细胞活性均在90%以上。经SB-431542处理的间充质层细胞的增殖活性低于对照组(P<0.05),而前成软骨层细胞增殖活性高于对照组(P<0.05),且3μmol/L和5μmol/L的SB-431542处理的前成软骨层细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.01)。试验表明,TGF-β可能在维持鹿茸间充质层细胞的快速增殖和诱导间充质细胞向软骨细胞分化等过程中起重要的作用。

SB431542对人牙龈间充质干细胞体外成骨分化的影响

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)信号通路抑制剂SB431542在体外对人牙龈间充质干细胞(hGMSCs)增殖及成骨分化能力的影响。方法:组织块法原代培养hGMSCs,采用流式细胞术检测表面标志物,然后给予不同浓度(0、0.1、1、10μmol/L)SB435142处理,CCK-8及流式细胞仪分别检测增殖活性及凋亡比例;成骨培养基分组诱导培养21 d后,进行茜素红染色,检测成骨分化;hGMSCs给予1μmol/L SB431542处理,采用Western blot检测成骨诱导过程中的成骨相关蛋白的表达及TGF-β信号通路信号分子的变化。结果:原代培养的hGMSCs高表达CD105、CD90和CD73,而阴性表达CD14、CD34、CD19、CD45和人类白细胞DR抗原(HLA-DR)。与对照组相比,各处理浓度SB431542并不引起hGMSCs凋亡率的明显改变(P>0.05)。而10μmol/L SB431542作用于hGMSCs第7天时,细胞增殖能力较对照组降低(P<0.05)。1μmol/L SB431542能显著增加hGMSCs矿化结节的形成(P<0.05),且在成骨诱导11 d后,Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于对照组及空白组(P<0.05)。成骨诱导30、60 min时,SB431542处理组的TGF-β信号通路下游Smad3信号分子磷酸化水平明显被抑制(P<0.05)。结论:SB431542可能通过抑制成骨分化过程中Smad3的磷酸化水平来诱导hGMSCs体外成骨。

CoCl2诱导黑素瘤A375细胞上皮间质转化、糖酵解及SB-431542干预研究

目的探讨CoCl 2刺激的黑素瘤A375细胞上皮间质转化和糖酵解的作用机制及SB-431542对此的干预作用。方法选用本团队前期已证实的安全有效浓度的CoCl 2(50~150μmol/L)刺激黑素瘤A375细胞,建立体外低氧模型,Western Blot检测HIF-1α、Nodal、上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin、MMP2及糖酵解各组分蛋白LDH-A、LDH-B的表达,以明确CoCl 2对A375细胞上皮间质转化和糖酵解的影响作用。随后研究SB-431542对Nodal-ALK4-ALK7介导A375细胞上皮间质转化和糖酵解反应的抑制作用:本部分拟筛选安全有效浓度的Nodal受体抑制剂(SB-431542)分别作用于CoCl 2介导的低氧模型,通过MTT实验确定SB-431542的安全浓度用于后续实验。Western blot检测SB-431542对CoCl 2诱导细胞上皮间质转化和LDH活化相关蛋白的影响;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱的变化情况;此外,使用Western blot检测Nodal及其受体(ALK4、ALK7)的表达。结果CoCl 2可显著上调细胞上皮间质转化相关蛋白Vimentin、MMP2和促瘤相关蛋白Nodal及其受体(ALK4、ALK7)的表达,且表达与作用浓度成正相关;CoCl 2能促进糖酵解活化相关蛋白表达,其中LDH-A表达上调,LDH-B的表达受到抑制(P<0.05)。MTT结果显示10μmol/L SB-431542处理48 h对细胞的增殖影响最小(P<0.05);SB-431542可抑制Vimentin、MMP2和Nodal及其受体ALK4、ALK7表达(P<0.05);促进糖酵解途径的相关蛋白LDH-A的表达下调(P<0.05),抑制糖酵解途径相关蛋白LDH-B的表达上调(P<0.05)。结论CoCl 2可诱导黑素瘤细胞上皮间质转化及糖酵解。SB-431542可通过抑制CoCl 2诱导的Nodal-ALK4-ALK7信号通路抑制与上皮间质转化及糖酵解相关分子的表达。

SB431542对人羊膜上皮细胞上皮间质转化的影响

目的探讨通过添加TGF-β抑制剂SB431542控制人羊膜上皮细胞的干性、表型和间质特性,为SB431542在预防人羊膜上皮细胞上皮间质转化(EMT)中的作用提供依据。方法使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞,通过细胞的增殖曲线和基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达的差异,筛选出最适浓度。以不加SB431542的细胞为对照组,以加最适浓度的SB431542为实验组,比较不同代次的对照组和实验组的细胞倍增时间,基因表达水平(CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2),流式检测细胞表面标志物(CD146、CD105、SSEA4)和免疫荧光检测细胞蛋白表达情况(CK8、ACTA2、EpCAM)的差异。结果使用不同浓度SB431542培养P2代人羊膜上皮细胞,5μmol/L SB431542培养条件下的细胞增殖曲线最优,且基因水平(CK8、ACTA2、OCT4和KLF4)表达最优,最终筛选最适药物浓度为5μmol/LSB431542完成后续实验。在5μmol/L SB431542培养条件下,P7代实验组的细胞倍增时间优于对照组;P7代实验组细胞的CK8、CK19、KLF4、OCT4的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平,实验组的ACTA2(α-SMA)和Vimentin表达水平明显低于对照组细胞的表达水平;P3和P5代细胞的实验组的间充质标志物CD146、CD105的表达量均比对照组的低,实验组干细胞标志物SSEA4的表达量均比对照组的高;P7代实验组的CK8和EpCAM表达效果强于P7代对照组细胞,且P7代实验组的α-SMA基本不表达。结论5μmol/LSB431542在人羊膜上皮细胞体外培养7个代次以内可以有效地抑制其上皮间质转化的发生。

SB-431542抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖和侵袭及其机理研究

肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因，TGF-β超家族成员Nodal分子被证实参与肿瘤细胞的增殖和转移，因而基于Nodal信号为靶标开展抗肿瘤研究成为可能。该研究应用Western blot检测乳腺癌细胞株BT-549、T-47D、MCF-7、SK-BR-3和MDA—MB-231中的Nodal和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达水平，发现它们在BT-549细胞中表达量最高。然后采用不同浓度_Nodal信号抑制剂SB．431542（1-50μmol／L）处理BT-549细胞48h，利用MTT法揭示20～50gmol／L的SB-431542抑制该细胞增殖。进一步利用细胞划痕和Transwell实验证明，10μmol／L的SB-431542可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。最后，通过明胶酶谱和Westernblot显示，10～30gmol／L的sB．431542可剂量依赖性地抑制MMP-2的表达和活性。上述结果说明，SB-431542通过阻断Nodal信号通路可效抑制乳腺癌细胞BT-549的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与降低MMP-2的表达和活性有关。

TGF-β_1受体阻滞剂对树突状细胞融合疫苗制备的影响研究

目的探讨TGF-β1受体阻滞剂SB-431542对树突状细胞(DC)融合疫苗制备的影响。方法①SB-431542(TGF-β1受体阻滞剂)与粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)联合应用,刺激C57BL/6小鼠骨髓来源DC成熟,应用聚乙二醇(PEG)融合技术融合DC和小鼠胰腺癌细胞(Panc02),制备融合疫苗。②观察细胞形态、细胞表面表达、MTT法检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。结果①在SB-431542参与下,成熟DC的细胞数目及形态无显著改变;②DC表面CD80、CD86、CD40的表达较未加SB-431542显著增高;MTT比色法,添加SB-431542的DC疫苗组对肿瘤细胞的杀伤抑制率显著提高。结论 SB-431542组融合细胞的分子表达较非SB-431542组显著提高;体外MTT显示SB-431542组有更好的抗肿瘤效应,说明SB-431542对增强融合疫苗抗肿瘤效应有明显的增强作用。

4-[4-(3,4-亚甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺的合成工艺改进

目的改进4 - [4 -(3,4 亚甲二氧基苯基) - 5 (2 - 吡啶基) 1H 咪唑- 2 - 基]苯甲酰胺(SB -4 315 4 2 )的合成工艺。方法关键中间体4 -[4- (3,4 - 亚甲二氧基苯基) - 5 -(2 - 吡啶基) - N 1 -羟基咪唑 -2 -基]苯腈(1)以三氯化肽[Ti(Ⅲ)Cl3 ]还原得到4 -[4 - (3,4 亚甲二氧基苯基) - 5 - (2 -吡啶基) - 1H 咪唑- 2 - 基]苯腈(2 ) ;2在叔丁醇中以氢氧化钾水解将腈基转化为胺酰基得到了SB -4 315 4 2。结果与讨论中间体和终产物经1H- NMR和MS鉴定,均与文献的数据相符。该合成工艺缩短了合成路线、简化了操作、提高了收率和纯度,避免了使用毒性大的亚磷酸三乙酯[P(OEt) 3 ]。

SB-431542对树突状细胞融合疫苗的制备和抗小鼠胰腺癌效应的影响

目的研究SB-431542对树突状细胞（DC）融合疫苗的制备和抗小鼠胰腺癌效应的影响。方法（1）SB-431542（转化生长因子-β1受体阻滞剂）与粒细胞集落刺激因子、白细胞介素4、脂多糖联合应用，刺激C57BL／6小鼠骨髓来源DC成熟，应用聚乙二醇融合技术融合DC和小鼠胰腺癌细胞，制备融合疫苗。②观察细胞形态、细胞表面表达、MTT比色法检测检测肿瘤细胞体外杀伤细胞毒活性。③制备荷瘤胰腺癌小鼠模型，分三组分别观察肿瘤体积大小，生存期观察。结果①在SB-431542参与下，成熟DC的细胞数目及形态无显著改变。②DC表面CD80、CD86、CD40的表达较未加SB-431542显著增高；MTT比色法，添加SB-431542的DC疫苗组对肿瘤细胞的杀伤抑制率显著提高。③体内抗肿瘤效应SB-431542的DC疫苗组肿瘤大小明显减小．生存期显著提高（P〈0．05）。结论SB-431542组融合细胞的分子表达较非SB-431542组显著提高，体外体内均显示SB-431542组有更好的抗肿瘤效应，说明SB-431542对增强融合疫苗抗胰腺癌特异性免疫效应有明显的作用。

TGF-β1抑制剂增加H460肺癌细胞的放射敏感性

探索一种TGF-β1受体激酶的选择性抑制剂SB431542对H460非小细胞肺癌细胞的放射增敏作用及对其DNA损伤应答体系的干扰。采用克隆形成实验检测SB431542对H460细胞放射敏感性的影响;用移植瘤实验验证SB431542在体内对H460细胞的放射增敏作用;采用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡;用免疫荧光检测53BP1 foci和磷酸化的DNA-PKcs foci。结果发现,SB431542可增加H460的放射敏感性。照射前用SB431542预处理H460细胞虽然快速启动了细胞的DNA损伤应答反应,但却抑制了DNA双链断裂的非同源末端链接修复,因此,导致细胞残留更多未修复的DNA双链断裂,从而产生更严重的细胞周期阻滞。研究还发现,这种增敏作用与细胞凋亡无关。体内移植瘤实验表明,与单独照射组相比,连续3次用SB431542联合5 Gy的X-射线处理明显在处理后第5～12 d之间降低了肿瘤的生长。这些结果显示,在照射前用SB431542抑制肿瘤细胞的TGF-β1通路,能降低其DNA损伤修复能力,改变细胞周期分布,降低细胞克隆形成能力,延缓肿瘤的生长,因此用SB431542抑制TGF-β1通路可作为一些类型肺癌病人放疗的有效辅助手段。

SB431542抑制TGF-β/Smad3信号通路在大鼠矽肺纤维化中的干预作用

目的探索SB431542抑制转化生长因子β(TGF-β)/Smad3信号通路在大鼠矽肺纤维化中的干预作用。方法将40只SPF级SD大鼠按随机数字表法分为4组:生理盐水对照组、模型组、SB431542抑制剂组和SB431542抑制剂对照组,每组10只。除生理盐水对照组外,其他3组采用非暴露气管注入法一次性气管内注入游离二氧化硅(SiO2)粉尘悬浊液1 ml(50 mg/ml);SB431542抑制剂组于染尘后第7、30天腹腔注射(5 mg/kg)SB431542;SB431542抑制剂对照组同样于染尘后第7、30天腹腔注射(5 mg/kg)SB431542助溶剂;生理盐水对照组气管内注入等量生理盐水(5 mg/kg)。在染尘后第60天,取大鼠右上叶肺组织石蜡包埋切片行苏木素-伊红(HE)染色;取左上叶肺组织用于实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测纤维黏连蛋白(FN)和胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢmRNA水平;取右肺下叶经蛋白免疫印记(Western blot)法检测肺组织中FN、COLⅠ、COLⅢ、磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad3蛋白水平。结果与生理盐水对照组比较,模型组大鼠肺组织有大小不等的结节状结构,部分肺泡间隔断裂,呈肺气肿改变,肺间质纤维化,肺组织FN、COLⅠ、COLⅢmRNA表达水平均升高,FN、COLⅠ、COLⅢ、p-Smad3和Smad3蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与SB431542抑制剂对照组比较,SB431542抑制剂组肺组织基本结构完整,未见明显结节,肺泡腔及细支气管腔内可见少量渗出物,肺组织FN、COLⅠ、COLⅢmRNA表达水平均降低,FN、COLⅠ、COLⅢ、p-Smad3和Smad3蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组和SB431542抑制剂对照组各因子mRNA和蛋白水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论SB431542可能通过阻断TGF-β/Smad3信号通路降低下游纤维化因子FN、COLⅠ、COLⅢ的表达,进而干预大鼠矽肺纤维化过程。

TGF-β受体阻断剂SB431542对SiO2粉尘诱导矽肺纤维化大鼠相关转录因子表达的影响

[背景]矽肺的发病机制尚不明确,且治疗手段有限,较为公认的机制是通过转化生长因子-β(TGF-β)诱导上皮间质转化(EMT)过程。SB431542作为TGF-β特异性受体阻断剂,在多种疾病中可阻断TGF-β/Smad3信号通路及下游的EMT通路,但其在SiO2粉尘诱导矽肺纤维化作用中尚未阐明。[目的]探讨TGF-β受体阻断剂SB431542对经SiO2粉尘诱导的矽肺纤维化大鼠转录因子表达的影响。[方法]40只SD雄性大鼠随机均分为四组:生理盐水对照组、矽肺模型组、SB431542抑制剂组和抑制剂对照组。对后三组大鼠和生理盐水对照组大鼠采用非暴露式气管注入的方法分别注入游离性SiO2粉尘悬浊液1 mL(50 g·L^-1)和等量生理盐水(5 mg·kg^-1)。染尘后第7、30天,SB431542抑制剂组腹腔注射SB431542(5 mg·kg^-1),抑制剂对照组腹腔注射SB431542助溶剂(5 mg·kg^-1)。染尘60 d后取材,取右肺上叶行HE及Masson染色,镜下进行病理观察;取左肺上叶,使用实时定量PCR法检测肺组织中神经型钙黏着蛋白(N-cadherin)、锌指转录因子1(Snail1)、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、扭曲基因(Twist)的mRNA表达水平,取右肺下叶使用蛋白质印记法检测肺组织中N-cadherin、Snail1、ZEB1、Twist的蛋白表达水平。[结果]由肺组织的病理结果中可见,与生理盐水对照组相比,矽肺模型组的肺组织有明显的灰白色矽结节,肺气肿样改变,肺间隔中有部分断裂,肺间质纤维化;SB431542抑制剂组肺组织比抑制剂对照组的肺泡结构稍完整,未见明显矽结节。与生理盐水对照组相比,矽肺模型组N-cadherin和各转录因子(Snail1、ZEB1、Twist)基因和蛋白水平均升高,m RMA的相对表达水平分别是生理盐水对照组的6.88倍、4.71倍、3.41倍和3.80倍;蛋白的相对表达水平是生理盐水对照组的1.48倍、1.94倍、1.49倍和1.45倍(P<0.05)。与抑制剂对照组相比,SB431542抑制剂组N-cadherin和各转录因子(Snail1、ZEB1、Twist)的基因和蛋白水平均降低(P<0.05)。与抑制剂对照组相比,矽肺模型组各基因和蛋白水平表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。[结论]SB431542通过阻断TGF-β与受体结合,使转录因子下调,抑制转录因子诱导的EMT过程,具有抑制矽肺纤维化进展的潜在作用。

转化生长因子-β1受体依赖的心肌纤维化伴随大电导钙激活钾通道的表达和功能下调

目的:探讨大电导钙激活钾通道(BKCa)是否参与转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的心肌纤维化过程,以及在这一过程中的作用机制。方法:分离培养乳大鼠心室成纤维细胞,并根据TGF-β1的不同浓度(5 ng/ml组、10 ng/ml组),以及在10 ng/ml TGF-β1基础上加入不同浓度TGF-β1受体特异阻断剂SB431542(0.1μmol/L组、1μmol/L组、10μmol/L组)进行分组,处理后提取蛋白及RNA,应用蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组TGF-β1受体蛋白,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、BKCa蛋白和信使RNA(mRNA)的表达情况。单通道及全细胞膜片钳技术记录TGF-β1作用24 h前后的BKCa电流特点及其变化情况。结果:TGF-β15 ng/ml组和10 ng/ml组均上调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和mRNA的表达,10 ng/ml组TGF-β1下调BKCa蛋白和mRNA的表达。与TGF-β110 ng/ml组相比,在10 ng/ml TGF-β1基础上加入SB4315421μmol/L组、10μmol/L组下调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和mRNA的表达,加入SB43154210μmol/L组上调BKCa蛋白和mRNA的表达,差异均具有统计学意义。此外,单通道及全细胞膜片钳技术记录结果表明TGF-β1预处理24 h后可明显抑制成纤维细胞上BKCa电流。结论:BKCa可能参与了TGF-β1诱导乳大鼠心室成纤维细胞纤维化通路,其机制可能是TGF-β1抑制了成纤维细胞上BKCa的电流。这提示BKCa可能是防治心肌纤维化的潜在靶点。

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1(TGF-β1)致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞向成纤维细胞转化的影响,及活化素受体样激酶5(activated receptor kinase 5,ALK5)抑制剂(SB-431542)对这一影响的干预作用。方法体外培养人RPE细胞,随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理,其余三组分别用10μg·L-1 TGF-β1、10μg·L-1 TGF-β1+30μmol·L-1 SB-431542、30μmol·L-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率;划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况;免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达;Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)以及纤维粘连素(fibronectin,FN)蛋白的表达。结果与对照组相比,TGF-β1作用于RPE细胞24 h后,可改变RPE细胞表型,使其呈成纤维细胞样外观,并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的(1.33±0.08)倍,30μmol·L-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L-1 TGF-β1处理组的(67.77±6.78)%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调,分别是对照组的(3.69±0.37)倍、(1.76±0.05)倍、(2.58±0.18)倍、(1.86±0.11)倍、(1.74±0.08)倍;SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调,分别是TGF-β1处理组的(67.73±5.15)%、(71.71±3.50)%、(79.87±0.05)%、(63.59±3.16)%、(83.07±2.31)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移,向成纤维细胞转化,并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达;SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。

缺氧状态下SB431542对视网膜血管内皮细胞的作用

目的观察并分析缺氧状态下SB431542对视网膜血管内皮细胞的作用。方法体内动物实验:健康C57BL/6J小鼠48只,随机分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+二甲基亚砜(DMSO)组、OIR+SB431542组,每组各12只。小鼠17日龄时,作视网膜铺片观察新生血管情况;苏木精-伊红染色计数突破视网膜内界膜(ILM)的血管内皮细胞核数。体内细胞实验:人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)分为正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组。噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况;Matrigel体外三维成型法检测SB431542对hRMEC管腔形成的影响;细胞划痕实验检测hRMEC内细胞迁移情况;Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪测定细胞内糖酵解、糖酵解储备、糖酵解容量的细胞外酸化率(ECAR)。多组间比较采用单因素方差分析。结果体内动物实验:与正常组比较,OIR组新生血管增多(t=41.621,P<0.001);与OIR组比较,OIR+SB431542组突破ILM的血管内皮细胞核数明显减少,差异有统计学意义(F=36.183,P<0.001)。MTT比色法检测结果显示,与正常组、缺氧+SB431542组比较,缺氧组、缺氧+DMSO组细胞增殖显著增多,差异有统计学意义(F=39.316,P<0.01);缺氧+SB431542组细胞增殖较缺氧+DMSO组显著降低,差异有统计学意义(t=26.182,P<0.001)。正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数、迁移细胞数比较,差异均有统计学意义(F=34.513、41.862,P<0.001、<0.01)。与缺氧+DMSO组比较,缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数、迁移细胞数明显下降,差异有统计学意义(t=44.723、31.178,P<0.001、<0.01)。细胞能量代谢测定结果显示,与缺氧+DMSO组比较,缺氧+SB431542组细胞内糖酵解、糖酵解储备的ECAR降低,糖酵解容量的ECAR增高,差异均有统计学意义(t=26.175、33.623、37.276,P<0.05)。结论SB431542可抑制缺氧诱导的hRMEC增殖、迁移及管腔形成能力,并降低细胞糖酵解水平。

增强定向造血分化信号提高人胚胎干细胞向自然杀伤细胞生成的效率

目的探讨在造血分化阶段增强定向造血(DH)信号对人胚胎干细胞(hESCs)分化形成的自然杀伤(NK)细胞(也称为hESC-NK细胞)生成效率和功能的影响。方法hESC(H1)经离心法形成拟胚体,在诱导造血分化的第0至8天,对照组加入BMP4、VEGF、bFGF、SCF等细胞因子;而增强定向造血(DH)组在对照组的基础上添加WNT激动剂(CHIR99021)和Nodal-activin抑制剂(SB431542);进而采用一致的方法分化形成NK细胞。使用流式细胞术和靶细胞K562共培养等方法分析造血分化效率、NK细胞生成效率、体外效应功能及表面受体等相关分子表达。结果相较于对照组,DH组在造血分化阶段第8天动脉生血内皮细胞(CD34^(+)DLL4^(+))数量显著增加,原始造血相关细胞(CD34^(-)CD43^(+))显著降低(P<0.05)。在NK细胞分化第28天分析发现,DH组NK细胞(CD45^(+)CD56^(+))数量显著增加,效应功能相关分子IFN-γ、Granzyme B、Perforin、CD107a虽微弱上升,但无统计学差异,激活性受体CD16a和CD69明显增加,但NKP46显著降低,抑制性受体NKG2A显著增加,CD96显著降低(P<0.05)。结论在hESC向造血分化过程中增强定向造血信号,在不影响NK细胞体外功能的情况下显著提高NK细胞生成效率和CD16a表达,为提高hESC-NK细胞或iPSC-NK细胞生成效率提供了一种新的思路。