17β-雌二醇对诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

研究了17β-雌二醇(E2)对培养的绵羊输卵管上皮细胞内SBD-1基因表达的影响.将不同剂量的17β-雌二醇加入传2代的绵羊输卵管上皮细胞内,分为实验组(10-6 mol/L组、10-7 mol/L组、10-8 mol/L组、10-9 mol/L组和10-10 mol/L组)和相应的对照组,分别处理2,6,12,24,48h,然后通过实时荧光定量RT-PCR技术,检测17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞内SBD-1mRNA的表达变化.结果显示:17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1mRNA的表达存在着时间效应和剂量上的依赖关系;17β-雌二醇可以上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1mRNA表达,上调表达的最佳时间为6h,最佳浓度为10-8 mol/L(P<0.01).

雌二醇对蒙古绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素(sBD-1)表达的影响

为了探索雌二醇与β-防御素（sBD-1）表达量的关系,体外模拟蒙古绵羊（Ovis aries）生理周期,用添加雌二醇浓度10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L的培养液及不添加雌二醇的培养液（即对照组）分别培养蒙古绵羊输卵管上皮细胞,作用24 h、48 h、72 h后,提取细胞总RNA,应用SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR法进行定量分析。结果显示,添加不同浓度雌二醇培养的输卵管上皮细胞中sBD-1的相对表达量0.000 740~0.001 758,与对照组0.000 190之间差异显著（P〈0.05）,且小于10-8mol/L雌二醇添加浓度与sBD-1基因相对表达量变化基本呈正相关。此结果为进一步研究雌激素参与机体防御功能奠定了基础。

酿酒酵母β-葡聚糖通过膜受体Dectin-1和TLR-2诱导绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1的机制研究

为了探索酿酒酵母β-葡聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中膜受体Dectin-1和TLR-2可能存在的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR、免疫荧光和Western blot等方法检测Dectin-1是否在ORECs内表达,并且采用qPCR和Western blot方法对β-葡聚糖刺激ORECs后细胞膜受体Dectin-1和TLR-2的表达变化进行检测。而后用不同浓度的Dectin-1阻断剂昆布多糖或TLR-2特异性封闭抗体分别预处理ORECs后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,以确定β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中Dectin-1和TLR-2的参与情况。结果显示:1)绵羊瘤胃组织及ORECs内存在Dectin-1表达,且β-葡聚糖刺激ORECs后Dectin-1和TLR-2的表达水平显著增加(P<0.05);2)不同浓度的昆布多糖和TLR-2封闭抗体均可以极显著降低β-葡聚糖诱导SBD-1的表达(P<0.01),且随着阻断剂和封闭抗体浓度的增加,其抑制SBD-1表达的作用越明显。结果表明,Dectin-1在绵羊瘤胃组织及ORECs内均表达,并且酿酒酵母β-葡聚糖在ORECs中诱导SBD-1的表达是由Dectin-1和TLR-2介导产生的。

几种不同信号通路的抑制剂对17β-雌二醇诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因转录的影响

主要探讨了17β-雌二醇(E2)促进绵羊输卵管上皮细胞SBD-1(sheep beta-defensin-1)表达的可能的信号通路.在研究过程中,分别用10-8mol/L 17β-雌二醇及雌激素受体拮抗剂ICI182780、PKA(protein kinase A)阻断剂H-89、PKC(protein kinase C)阻断剂H-7、NF-κB(Nuclear factor-kappaB)阻断剂PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate)干预绵羊输卵管上皮细胞6 h,采用实时荧光定量RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)方法检测SBD-1 mRNA表达水平的变化.实验结果显示,10-8mol/L 17β-雌二醇可显著促进绵羊输卵管上皮细胞SBD-1 mRNA的表达(p<0.01);ICI182780、H-89、PDTC和H-7均可阻断17β-雌二醇对SBD-1的上调作用.提示17β-雌二醇促进绵羊输卵管上皮细胞SBD-1表达是由雌激素核受体、PKA、NF-κΒ、PKC信号转导通路所介导的.

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。

蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1) cDNA的扩增与组织表达

为了获得蒙古绵羊β-防御素-1(SBD-1)的cDNA序列,从蒙古绵羊瘤胃的上皮组织中提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增蒙古绵羊SBD-1的部分cDNA,结果扩增出cDNA 300个碱基.该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸的前原防御素.为了检测SBD-1mRNA在蒙古绵羊体内可能的表达器官,通过RT-PCR方法研究了SBD-1基因在蒙古绵羊各组织中的表达分布,结果显示,该基因在整个消化道(除直肠外)、气管、子宫、脾脏等管状器官内的黏膜层和脾脏内均有表达,而在所检测的实质性器官内,如心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、卵巢等中没有表达.

17-β-雌二醇对培养的绵羊输卵管上皮细胞β-防御素(sBD-1)mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,根据体内雌激素浓度确定17-β-雌二醇添加的浓度分别为10-8、10-9、10-10、10-11mol/L,提取细胞总RNA,利用实时荧光定量RT-PCR测定sBD-1-mRNA的相对表达量。结果显示:一定浓度范围内(10-8、10-9、10-10mol/L),17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞sBD-1-mRNA的表达有促进作用,且呈正相关。结果表明:雌性生理周期下,雌性生殖道sBD-1-mRNA的表达与雌激素相关。

LPS通过TLR4影响绵羊输卵管上皮细胞SBD-1的表达

旨在研究脂多糖(LPS)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响及其调控途径,本研究设置不同浓度(10ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1、1mg·mL-1)LPS,分别作用不同时间(0、1、3、6、12和24h),检测绵羊输卵管上皮细胞SBD-1和Toll样受体-4(TLR4)mRNA表达水平,通过免疫组化检测SBD-1表达定位,并进一步通过TLR4阻断试验来证实TLR4介导LPS引起SBD-1表达。结果表明,SBD-1蛋白表达于输卵管上皮细胞。LPS以浓度和时间依赖方式影响绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1的表达,且100ng·mL-1 LPS在作用12h后,SBD-1的表达水平达到最高。阻断试验表明,TLR4介导LPS对SBD-1的表达调控。综上表明,LPS可以影响绵羊输卵管上皮细胞表达SBD-1,且该过程通过TLR4介导。

SBD-1型数字白度仪调试实例

SBD—1型数字白度仪是由光、电两大部分组成的一个光学测量系统。它是根据光电效应原理,采用双光路和模数转换电路,来测量试样表面漫反射的辐亮度与同一幅照条件下完全漫反射体的辐亮度之比,来达到测量的目的。 SBD—1型数字白度仪随着使用时间的延长,就可能出现一些问题。如在调修仪器时,遇到下列问题,应该怎样处理呢? 一、荧光白度高了或低了怎么办?

洼地绵羊防御素sBD-1基因克隆、序列分析及SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的建立与应用

根据GenBank上登录的绵羊防御素基因序列,经多重比较后,设计1对引物,从洼地绵羊舌上皮组织中扩增到防御素sBD-1基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序。结果表明,扩增基因全长215 bp,编码64个氨基酸。基因进化树分析表明,与蒙古绵羊sBD-1基因有较近的亲缘关系,核苷酸同源性为98.5%;而与黄牛的亲缘关系最远,核苷酸同源性84.6%。氨基酸序列分析表明,序列内无信号肽区域,具有3个潜在的抗原表位。以pMD18-T/sBD-1质粒为模板建立了sBD-1基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,核酸电泳、扩增动力学曲线、溶解曲线及重复性试验表明,检测方法具有良好的稳定性和特异性,得到的回归方程(R2=0.998)表明PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在良好的线性关系,从舌、盲肠及输卵管等组织中可以进行有效的检测,检测灵敏度为83.9 copies/μL。该方法为进一步研究防御素sBD-1基因在洼地绵羊抗逆性过程中的作用奠定了基础。

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1(SBD-1)mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10-8 mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C(PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A(PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1 h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10-8mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h,SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。

17β-雌二醇通过ERK1/2途径诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1的表达

目的探讨17β-雌二醇(E_(2))对输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)mRNA基因表达的影响以及相关信号通路作用机制。方法利用10^(-8) mol/L E_(2)培养绵羊输卵管上皮细胞6 h,分别添加MAPK/ERK1/2信号通路阻断剂和PI3K信号通路阻断剂,通过RT-qPCR技术检测SBD-1 mRNA的表达变化。结果 E_(2)可以上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1 mRNA表达(P<0.05);添加ERK1/2信号通路阻断剂能够抑制了E_(2)诱导的SBD-1 mRNA的表达(P<0.05);添加PI3K信号通路阻断剂后SBD-1 mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。结论 E_(2)诱导的SBD-1 mRNA的表达与ERK1/2信号通路有关,而PI3K信号通路可能不参与。

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定。首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR。以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算sBD-1 mRNA的相对表达量。经测序分析,扩增产物为β-防御素。结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量。

孕酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外实验模型,分别添加10-6、10-7、10-8、10-9和10-10mol/L孕酮,运用实时荧光定量PCR方法测定孕酮对上皮细胞内β-防御素相对表达量的影响。结果显示,与对照组比较,10-6和10-7mol/L孕酮组β-防御素相对表达量显著升高(P<0.05);10-8和10-9mol/L孕酮组极显著升高(P<0.01);而10-10mol/L孕酮组未见显著性差异。孕酮添加组间比较显示,10-8和10-9mol/L孕酮组极显著高于10-10mol/L组(P<0.01),其它孕酮添加组间未见显著性差异。分析认为,一定浓度的孕酮(10-9-10-6mol/L)对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用。且不同浓度的孕酮对β-防御素表达的影响程度不同。因而推断,雌性生理周期下,雌性生殖道β-防御素的表达与孕激素相关。

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(C t值)计算β-防御素基因的相对表达量。结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量。

绵羊β-防御素在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

根据GenBank中绵羊β-防御素(SBD-1)的全长cDNA序列设计合成1对引物,PCR扩增SBD-1基因并与T载体成功连接,然后将其成熟肽编码片段亚克隆到毕赤酵母表达载体Ppic9k上,构建真核表达质粒Ppic9k-mSBD-1,将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达,表达产物纯化后进行活性鉴定。结果表明,mSBD-1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。