抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)淀粉分支酶SBEⅡa和SBEⅡb基因多态性分析

【目的】克隆抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)中淀粉合成酶关键基因SBEⅡa和SBEⅡb进行多态性分析,从分子水平阐述不同小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。【方法】根据Gene Bank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)和SBEⅡb(AY740401.1)基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa和SBEⅡb基因序列,利用Clustal.W进行测序结果的比对分析,NCBI Conserved domain和inte Pro在线网站对SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列进行结构域预测,寻找影响抗性淀粉含量的主效基因位点。【结果】克隆了SBEⅡa(2 471 bp)、SBEⅡb(2 510 bp)基因ORF(open reading frame,ORF)全长。序列分析表明:SBEⅡa、SBEⅡb基因与公布的序列同源性分别为98.64%和99.07%。【结论】SBEⅡa基因ORF的三个结构域中未发现影响籽粒抗性淀粉含量的候选差异位点。在SBEⅡb基因编码区羧基C-末端的3个候选差异位点和α-淀粉催化酶结构域的1个候选差异位点可能是造成小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。SBEⅡa、SBEⅡb氨基N-末端前面序列中共计10个单碱基变异作为潜在差异位点,也可能参与SBE基因的表达。

小麦SBEⅡb基因的克隆及其与PDS基因串联VIGS载体的构建

为探讨以PDS基因为指示基因利用VIGS技术研究小麦SBEⅡb基因的功能,本研究拟构建小麦SBEⅡb和PDS的双基因串联VIGS重组载体。根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡb(AY740401.1)和PDS(FJ517553.1)基因序列分别设计搭桥引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡb和PDS基因的特异片段,利用SOE-PCR技术获得双基因融合片段SBEⅡb:PDS。然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接,用SBEⅡb:PDS基因片段将原载体中的PDS基因片段进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。结果显示克隆的SBEⅡb和PDS基因片段长分别是181和190 bp,SBEⅡb:PDS片段长是370 bp。序列分析表明:SBEⅡb基因片段与小麦SBEⅡb(AY740401.1)序列同源性为97%;小麦PDS基因片段与PDS(AF155217.2)序列同源性也为97%;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体。本研究构建的BSMV:γ-SBEⅡb:PDS重组载体将在PDS基因的指示下为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡb基因与小麦淀粉合成的关系奠定了基础。

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡ b高效沉默表达载体的构建及转化表达

淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体p TFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。

小麦淀粉分支酶基因SBE-Ⅱb植物表达载体的构建及表达鉴定

从花后15 d的小麦(Triticum aestivum L.)胚乳中提取RNA,根据GeneBank上已经公布的小麦淀粉分支酶基因(SBE-Ⅱb)序列(AY740401.1)设计引物,经RT-PCR扩增得到一条2 511 bp的条带,测序结果与公布的序列一致。将克隆得到的基因构建到了植物表达载体pPZP35S上,通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增鉴定证明,SBE-Ⅱb基因已成功转入烟草细胞中,获得4个转基因株系。转基因烟草叶片与野生型比较,颜色变暗,植株较小。RT-PCR半定量和实时荧光定量RT-PCR分析表明,转基因烟草株系的叶片中有SBE-Ⅱb基因的表达,与对照植株相比,转SBE-Ⅱb基因的植株中的转录本达到了显著性的变化,但是其淀粉分支酶活性没有达到显著性变化。

农杆菌介导水稻sbeIIb基因转化体系的建立

本文对水稻愈伤组织再生体系及其转化影响因子进行了研究。以水稻品种秀水11的幼胚和成熟胚为外植体,以M S+肌醇0.1g/L+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.2mg/L+脯胺酸2.8g/L+水解酪蛋白0.3g/L作诱导培养基,愈伤组织诱导率最高为73.45%,愈伤组织在M S+6-BA2 mg/L+NAA 0.5mg/L的分化培养基上,分化频率达53.33%;在此基础上对农杆菌介导水稻愈伤组织转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:预培养时间3d,在OD600值为0.6农杆菌菌液中感染10m in,共培养3d。

玉米ae基因的研究进展

ae基因是一种胚乳突变基因。玉米ae突变体的表现型为玻璃状、无光泽胚乳。ae基因编码淀粉分枝酶Ⅱb(SBEⅡb)是SBEⅡb的结构基因,ae基因定位在玉米第5条染色体长臂上,在玉米中是单拷贝基因。在ae突变体胚乳中,SBEⅡb的活性缺失,子粒的表观直链淀粉含量增加,同时支链淀粉的α-l,6糖苷键分支点的数量降低。本文对ae基因的结构、功能、特性等作了一个较全面的综述,对其做更深入的研究,以改良淀粉品质。