嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者RET、VHL、SDHD、SDHB遗传基因变异的检测

目的:检测嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者的4种与该病相关基因(RET、VHL、SDHD、SDHB)的胚系遗传变异,以了解我国该病患者上述基因变异情况。方法:以2012年9月至2014年3月就诊于北京大学第一医院,并经病理确诊的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者为研究对象,共入选12例,其中嗜铬细胞瘤患者11例,副神经节瘤患者1例。提取患者外周血白细胞DNA,采用PCR技术扩增RET基因的第10、11、13~16外显子,VHL、SDHD、SDHB基因的全部外显子,以及各外显子的邻近内含子(±20 bp),并对扩增产物进行测序。比对测序结果及野生型序列,确定基因变异。对1例诊断为多发性内分泌腺瘤病2A型的患者进行家系分析,在家族成员中检测相应基因变异。结果:共3例患者发现胚系基因变异:1例恶性嗜铬细胞瘤患者存在SDHB基因c.136C>T(p.R46X)变异;1例多发性内分泌腺瘤病2A型患者存在RET基因c.1901G>A(p.C634Y)变异及c.2071G>A(p.G691S)/c.2712C>G(p.S904S)变异,其家系中发现其他5名成员携带上述变异;1例散发、无恶性表现的嗜铬细胞瘤患者存在RET基因c.2071G>A(p.G691S)/c.2712C>G(p.S904S)变异。1例患者存在先天性单心室畸形合并嗜铬细胞瘤,其上述4个基因均未发现有临床意义的变异。结论:本研究在25%(3/12)的嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者中发现了错义或无义胚系基因变异,包括SDHB基因的c.136C>T(R46X)变异、RET基因的c.1901G>A(C634Y)变异以及RET基因的c.2071G>A(p.G691S)/c.2712C>G(p.S904S)变异等,其中前两种变异具有明确的致病性。本研究验证了上述变异在嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者中的存在,临床工作中应该对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤患者开展广泛的遗传基因筛查。

嗜铬细胞瘤PLAGL1基因表达及甲基化水平与SDHB基因突变相关性研究

背景与目的:PLAGL1基因是一种新发现的肿瘤抑制基因,具有诱导凋亡和细胞周期阻滞的功能。本研究旨在检测PLAGL1在嗜铬细胞瘤组织基因表达水平及上游调控区甲基化状态,并分析PLAGL1基因表达、甲基化情况与SDHB基因突变的关系,以探讨其在嗜铬细胞瘤诊断及治疗中的意义。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测PLAGL1基因在13例正常肾上腺髓质、32例良性嗜铬细胞瘤组织及54例恶性嗜铬细胞瘤组织中的表达;甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)技术检测PLAGL1基因上游调控区甲基化水平。SDHB基因扩增后直接测序分析突变情况。结果:PLAGL1基因在恶性肿瘤组织、良性肿瘤组织及正常肾上腺髓质中的相对表达量分别为(0.527±0.201)、(1.517±0.662)和(1.734±0.756),在恶性肿瘤组织与良性肿瘤组织及正常组织间表达水平差异显著,良性肿瘤组织与正常组织间差异无统计学意义(P>0.05),PLAGL1的低表达与恶性嗜铬细胞瘤组织PLAGL1基因上游调控区甲基化密切相关,在恶性肿瘤组织、良性肿瘤组织及正常肾上腺髓质中甲基化发生率分别为68.5%(37/54)、18.8%(6/32)和15.4%(2/13),7例恶性肿瘤组织SDHB基因发生突变,在良性肿瘤组织与正常组织中未检测到突变的发生。结论:PLAGL1基因的低表达与嗜铬细胞瘤恶性程度相关,其低表达与上游调控区甲基化有关,与SDHB基因突变情况有待进一步验证。

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB（succinate dehydrogenase complex，subunit B）基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长。采用PCR技术扩增出SDHB基因，并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中，经酶切及测序鉴定后，转化BL21细菌，并用IPTG诱导表达融合蛋白，谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化，将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，并用Western blot检测抗体。获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体，为SDHB进一步的功能研究奠定了基础。

多主棒孢SdhB-H278R突变位点AS-real-time PCR定量检测体系的建立

【目的】建立一种快速、高效、定量检测黄瓜多主棒孢(Corynespora cassiicola)琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)H278R突变的实时荧光定量PCR(AS-real-time PCR)检测方法,并进行效果验证。【方法】从北京市大兴区采集、分离纯化病原菌,获得24株多主棒孢的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对啶酰菌胺的EC50,随机选取4株敏感(S)和8株抗性(R)菌株测其菌丝生长速率、产孢量和致病性。采用引物对Cc-SdhB-F/R测定多主棒孢SdhB基因序列,检测SdhB的碱基变化。基于多主棒孢SdhB的相同核酸序列和SNP位点设计内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14,建立并优化AS-real-time PCR定量检测体系,并对引物的特异性、熔解曲线和灵敏度进行评价。利用该体系分别检测含有H278R不同突变比例的DNA和孢子悬浮液。【结果】测定的24个菌株中,敏感菌株占66.7%,EC50值为0.057—0.563μg·mL^(-1);抗性菌株占33.3%,EC50值为5.395—11.710μg·mL^(-1)。抗性和敏感菌株仅在菌丝生长速率方面存在显著性差异,且菌丝生长速率与EC50之间存在显著负相关。在产孢量和致病性方面不存在显著性差异。测序分析发现抗性菌株均携带SdhB-H278R突变。本研究设计的引物B-H278R-2F和B-H278R-2F2R14特异性强,仅对多主棒孢SdhB-H278R突变菌株的DNA有扩增条带,对其余供试菌株均无条带扩增。普通AS-PCR检测的灵敏度为91 pg·μL^(-1),而AS-real-time PCR的灵敏度可达9.1 pg·μL^(-1),灵敏度为普通AS-PCR的10倍。以基因组DNA为标准品,构建的AS-real-time PCR标准曲线ΔCT值与相对模板浓度的对数有良好的线性关系,相关系数为0.9857,扩增效率为92.59%。熔解曲线吸收峰单一,内参引物B-H278R-TY-F/R和特异性引物B-H278R-2F/2R14分别在87.81℃和91.62℃处出现单一特异性峰。用DNA和孢子悬浮液对标准曲线进行验证,结果表明随着相对模板浓度逐渐降低,该检测体系的准确性逐渐升高且检测下限为5%,同时预期值与试验值呈线性相关(R^2=0.9998和R^2=0.9922)。【结论】建立了一种高效、定量、快速的AS-real-time PCR检测体系用于SdhB-H278R突变位点的检测,可为杀菌剂的抗性治理提供理论依据。

散发性嗜铬细胞瘤患者SDHB基因突变筛查

应用PCR扩增102例嗜铬细胞瘤患者抑癌基因SDHB并直接测序，结果显示有3例患者存在基因突变，分别为2号外显子CGA→TGA（R46X）、3号外显子CGA→TGA（R90X）和7号外显子CGC→CAC（R242H），推测抑癌基因SDHB在散发性嗜铬细胞瘤患者中的突变率约为3％。

SDHB基因突变相关儿童左上纵隔嗜铬细胞瘤1例并文献复习

目的分析1例罕见的儿童左上纵隔嗜铬细胞瘤临床特征及其遗传机制。方法采集患儿及其家系的临床资料。采用靶向捕获二代测序技术对患儿进行外显子组测序,再采用Sanger测序对患儿家系进行验证。结果患儿临床诊断为左上纵隔嗜铬细胞瘤,后于全身麻醉下行纵隔肿瘤切除术。测序发现患儿携带SDHB基因杂合突变(c.136G>A,p.46R>X),患儿父母均未携带该突变。目前患儿已随访3年余,未予药物治疗,情况良好。结论对临床诊断为嗜铬细胞瘤患儿进行基因检测,有助于确诊和预后评估,更有助于对患儿家族成员的遗传咨询。

SDHB基因错义突变致心脏副神经节瘤一例

患者青年女性。以阵发性心悸、多汗、头痛、血压升高为表现,检测儿茶酚胺及代谢产物甲氧基肾上腺素类(MNs)水平增高,基因检测为琥珀酸脱氢酶亚基B(SDHB)错义突变,影像学检查发现由冠状动脉左回旋支供血的纵隔肿瘤(40 mm×38 mm),经充分药物准备后在体外循环下行肿瘤手术切除,术后病理确诊为心脏副神经节瘤。患者术后3个月随诊复查血压、MNs正常,并对其家系进行了研究追随。

SDHB基因新发剪接突变导致下腔静脉旁副神经节瘤一例分析

嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(pheochromocytoma/paraganglioma,PPGL)是起源于嗜铬组织的神经内分泌源性肿瘤,是继发性高血压的重要原因之一。随着临床研究进展,发现遗传性PPGL约占PPGL 35%~40%,且目前已经发现PPGL的致病基因至少有17个,其中SDHB基因突变常见于副神经瘤,且约40%的恶性PPGL与SDHB基因突变有关。本文报道1例SDHB基因新发剪接突变导致的PPGL。

3例无功能原发性肺副神经节瘤临床病理及分子遗传学分析

病例1,患者男性,21岁。因无明显诱因出现咯血1年,气紧2个月于2019年3月就诊于四川大学华西医院。纤维支气管镜检查示:气管上段新生物,直径2.6 cm(图1)。后行气管肿瘤切除术。病例2,患者女性,49岁。因体格检查发现右肺包块1个月于2017年9月收入本院。

2,4-二羟基苯甲酸铅铜盐对Al/RDX-CMDB推进剂燃烧性能的影响

为了研究2，4-二羟基苯甲酸铅铜盐（Pb／Cu-SDHB）单独或与其它催化剂复合后对含Al粉和黑索今（RDX）改性双基（AI／RDX-CMDB）推进剂燃烧I生能的影响，采用吸收．压延方法制备了推进剂样品，用靶线法测试了推进剂燃速。结果表明：Pb/Cu-sDHB能有效调节推进剂燃烧性能，显著提高了A1／RDX-cMDB推进剂的燃速，并明显降低了压强指数；3．0％Pb／Cu-SDHB与0．65％炭黑复合后使A1RDX-cMDB推进剂在10~15MPa的压强指数降低至．0．1，10MPaT燃速黜0mm／s。

琥珀酸脱氢酶缺陷型肾癌的临床病理特征

目的探讨琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)缺陷型肾癌的临床病理特征、诊断及治疗。方法分析SDH缺陷型肾癌的临床病理特征、免疫表型及分子遗传学特征。结果肾肿瘤灶呈实性、灰黄色,质软。镜检见肿瘤边界清楚,细胞排列呈实性、巢状、小管状,细胞质空泡状,胞质内含嗜酸性或浅染的絮状物质,未见核分裂像及坏死。免疫组织化学染色显示PAX8、CK(AE1/AE3)、EMA、P504s均阳性,SDHB阴性。患者组织蜡块全外显子测序结果提示SDHB基因外显子区域发现一处杂合突变。(c.725G>Ap.R242H)。结论SDH缺陷型肾癌发病率罕见,具有特征性的病理组织形态学表现、免疫表型呈特征性的SDHB表达缺失。在临床诊疗过程中,应详细询问患者病情及家族遗传史,必要时进行基因检测明确诊断。

膀胱副神经节瘤8例临床病理特征及预后风险分析

目的 探讨膀胱副神经节瘤(paraganglioma of urinary bladder,PUB)的临床病理特征和预后风险因素。方法 收集8例PUB临床资料,行HE、EnVision两步法染色,分析其与临床病理特征的关系,并复习相关文献。结果 8例患者中女性5例,男性3例,平均发病年龄54岁。3例表现为高血压、头痛、心悸、阵发性肉眼血尿等典型临床症状,其余5例体检发现膀胱病变。肿瘤细胞大部分呈经典的巢团状排列,核分裂象及坏死罕见,瘤细胞巢周围见支持细胞围绕,肿瘤细胞表达Syn、CgA、CD56,仅1例SDHB表达缺失,支持细胞S-100表达,肿瘤细胞Ki-67增殖指数均≤2%,7例GAPP评分为0~2分,1例为5分。随访时间19~99个月,1例术后36个月出现局灶复发,均未发现转移。结论 PUB临床罕见,组织形态与生物学行为不一致,具有复发及转移风险,GAPP评分系统有助于评估PUB的转移风险,SDHB可作为预测PUB转移风险的常规指标。

抑制线粒体复合体Ⅱ诱导线粒体自噬影响细胞增殖的研究

线粒体复合体Ⅱ,也被称为琥珀酸脱氢酶,参与线粒体呼吸作用及代谢重编程的调控过程.复合体Ⅱ由4个亚基构成,其突变与肿瘤的发生密切相关.本文探讨复合体Ⅱ与线粒体自噬调控及细胞增殖之间的关系.实验采用复合体Ⅱ的特异性抑制剂TTFA或敲除复合体Ⅱ的B亚基(SDHB)使其功能缺失.结果发现,复合体Ⅱ功能的缺失显著引起线粒体形态的片段化进而发生线粒体自噬,导致线粒体蛋白水平减少,抑制ATP生成;由于线粒体功能受到抑制,细胞葡萄糖消耗及乳酸产生水平增加,并显著抑制细胞的细胞的增殖.综上所述,复合体Ⅱ功能缺失可能通过调控线粒体自噬而影响细胞增殖,从而在肿瘤发生中起重要作用.

灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性

为明确灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性差异,将9个不同敏感型菌株在无药PDA平板上继代培养10代后,测定其对氟唑菌酰羟胺的敏感性。采用菌丝生长速率法分别在PDA平板和离体叶片上测定了其菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性,以及其对温度、pH值和葡萄糖的敏感性,并对其编码琥珀酸脱氢酶的SdhA、SdhB、SdhC和SdhD 4个亚基基因进行了克隆与测序。结果显示:从田间获得的2个低抗菌株、2个中抗菌株和2个高抗菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数在0.60~1.15之间,而通过室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数为0.23;除低抗菌株WP8的菌丝生长速率显著低于2个敏感菌株,以及中抗菌株WP6和高抗菌株WPE9的产孢量显著低于2个敏感菌株外,其余各抗性菌株在菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性方面均无显著差异。整体而言,7个抗性菌株在对温度、pH值和葡萄糖的敏感性方面与敏感菌株无显著差异。基因克隆及测序结果表明,室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F SdhB基因的272位由组氨酸变为了精氨酸(H272R),田间获得的低抗、中抗和高抗各2个菌株均为SdhB基因的225位由脯氨酸变为了亮氨酸(P225L)。综合分析表明,灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株具有相似的适合度。因此,推测在药剂的选择压下,抗氟唑菌酰羟胺的灰葡萄孢菌株在田间容易形成优势种群。

ATP5A1在结肠癌中的表达及临床意义

目的 分析ATP5A1在结肠癌中的表达情况及其意义,研究ATP5A1表达变化导致结肠癌细胞分子及功能改变的机制,为针对结肠癌的精准治疗提供依据。方法 采用免疫组化结合生存期组织芯片研究ATP5A1在结肠癌及癌旁组织的表达变化及其与临床病理特征的关系,结合TCGA数据库分析ATP5A1表达改变对结肠癌生存率的影响。采用高分辨质谱分析ATP5A1表达改变对结肠癌总蛋白表达的影响。采用CCK-8法分析ATP5A1表达改变对氧化磷酸化通路不同抑制剂的影响。结果 ATP5A1在结肠癌组织中的表达水平高于对应癌旁组织,而患者的ATP5A1高表达预示着较长时间的生存期。蛋白质组学分析发现,随着ATP5A1表达增加,结肠癌细胞各呼吸链复合物都有不同程度的表达上调,尤以复合物II中的SDHB蛋白表达增高最为显著。TTFA和oligomycin A在低表达ATP5A1和SDHB的细胞系中表现出更明显的抑制细胞增殖的能力。结论 氧化磷酸化呼吸链的不同组分间的协同变化反映了结肠癌存在线粒体重塑现象,研究该现象有助于针对结肠癌采用更精准的治疗策略。

琥珀酸脱氢酶基因B亚单位在散发性副神经节瘤中的突变

目的:探讨人线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)基因B亚单位(SDHB)基因突变与散发性副神经节瘤之间的关系。方法:取8例散发性副神经节瘤患者的肿瘤石蜡标本,提取基因组DNA,对SDHB基因的8个外显子进行PCR扩增和测序分析,与Genebank中人类SDHB基因序列及SNP数据库比对,寻找突变位点。结果:8例肿瘤组织标本中,在64个外显子中发现8例9个核苷酸改变。其中1例1个核苷酸改变为基因点突变,突变率为12.5%,为第2外显子第64位碱基C突变为T(c.136C>T),导致第2外显子编码的第22位密码子由精氨酸密码子突变为终止子(p.Arg46X)。另外8例8个为单核苷酸多态性改变。结论:散发性副神经节瘤患者中存在SDHB基因突变,可能与副神经节瘤的发生有关。

基因突变对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤临床特征及预后的影响

目的分析基因突变对嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(PPGL)患者的临床特征及预后的影响。方法回顾性分析北京核工业医院2019年1月至2022年6月收治的PPGL患者的临床特征、无进展生存期(PFS)在是否存在基因突变方面的差异。结果PPGL患者临床表现多样,以高血压最常见(78%)。26例(51%)患者出现基因突变,类型以SDHB最多(62%);具有基因突变患者中有20例(77%)有高血压。是否具有基因突变在年龄方面差异具有统计学意义(P<0.05)。有基因突变组患者的中位PFS(27个月)短于无基因突变组(80个月),差异有统计学意义(P<0.05)。结论PPGL患者无论有无基因突变其临床表现以高血压最为常见,临床症状多样,缺乏特异性。基因突变以SDHB最为常见,具有基因突变的患者年龄相对较轻,并且出现疾病进展速度较快。

胃肠道间质瘤的基因检测与临床、病理、影像的相关性研究

目的探讨胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)中c-Kit/PDGFRA基因突变、琥珀酸脱氢酶(SDHB)表达缺失与临床病理特征的关系以及MSCT影像学表现在GIST分子诊断过程中的临床应用价值。方法收集2009年1月至2017年10月中经手术病理证实的172例GIST患者的临床、病理和影像学资料,采用直接测序法检测标本中c-Kit/PDGFRA基因突变情况,随后在野生型GIST中应用免疫组织化学染色的方法检测SDHB表达情况。结果与野生型相比,c-Kit/PDGFRA基因突变型GIST更易发生在年龄大的患者、肿瘤坏死及核分裂象易见、危险度分级更高、CD34、CD117及DOG-1的阳性表达率更高(P<0.05)。SDHB缺陷型GIST与野生型相比,较少出现肿瘤坏死及Ki-67增殖指数较低,SDHB缺陷型和SDHB野生型GIST在增强△CT值间的差异显著(P<0.05),SDHB缺陷型的增强△CT值明显高于野生型。而c-Kit/PDGFRA基因是否突变在增强△CT值间的差异不显著,两组平扫期△CT值的对比均无统计学意义(P>0.05)。结论GIST中c-kit/PDGFRA基因的突变与SDHB的表达具有不同的临床及病理学特征,CD34、CD117及DOG1的表达情况可作为预测GIST患者cKit/PDGFRA基因突变的指标。增强△CT值的变化对于MSCT诊断SDHB野生型GIST具有重要的指导意义。