迟发性脊柱骨骺发育不良家系SEDL基因突变研究

目的迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)是一种X线表现明显的X连锁骨发育不良疾病,主要特征包括不成比例的短躯干型矮身材、大关节发育不良以及胸腰椎椎体扁平。文中鉴定SEDT家系SEDL基因的突变位点,探讨SEDT发病的分子遗传学机制。方法报告1个4代68人累及8例患者的SEDT大家系,患者均为非匀称性矮身材(短躯干),临床诊断为X连锁SEDT。提取家系所有成员及50例正常对照者血样中白细胞基因组DNA,应用PCR和DNA测序进行SEDL基因突变分析。结果DNA序列分析表明,家系8例患者均为SEDL基因外显子6发生插入突变(c.370-371 ins A,突变数据库检索未见报告,为一全新突变方式),并发现1例无症状患儿携带相同方式突变(症状发生前),6例女性携带者为杂合突变,家系其他成员和正常对照者中均未见该插入突变。结论SEDL基因c.370-371 ins A是一新突变方式,详细的临床与分子遗传学研究丰富了SEDT的基因型-表型谱。SEDL基因突变分析对携带者检测、症状前诊断以及患者和携带者的产前基因诊断具有重要意义。

SEDL基因突变致迟发性脊柱骨骺发育不良机制的初步研究

目的迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)是一种X线表现明显的X连锁骨发育不良疾病,主要特征包括不成比例的短躯干型矮身材、大关节发育不良以及胸腰椎椎体扁平。文中初步研究SEDL基因突变致SEDT的机制。方法将野生型SEDL基因及其突变型(c.370-371insA)重组真核表达质粒分别转染COS-7细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,激光共聚焦显微镜下观察重组蛋白表达的亚细胞定位,应用透射电镜观察转染细胞的超微结构。结果野生型和突变型重组质粒的转染效率分别为47.51%和46.39%。野生型重组Sedl-in蛋白主要定位于核周,而突变型Sedlin蛋白则主要分布于细胞核以及部分在胞质表达。超微结构显示转染SEDL突变型重组质粒的细胞溶酶体显著增多。结论SEDL基因c.370-371insA突变导致Sedlin蛋白细胞定位的变化可能是SEDT发病的分子机制。

干扰SEDL基因表达对软骨细胞生理活性的影响

目的初步研究干扰SEDL基因表达后对人软骨细胞中II型胶原蛋白表达水平、内质网位置分布及超微结构和软骨细胞活性的影响。方法将靶向干扰SEDL基因的病毒转染入人软骨细胞中,QPCR及Western Blot分别检测SEDL基因及Sedlin蛋白表达水平,评价干扰SEDL基因的软骨细胞模型是否建立成功;免疫荧光及Western Blot检测II型胶原蛋白表达情况,荧光探针检测内质网位置分布改变,电镜检测内质网超微结构改变,MTT法检测软骨细胞增殖活性情况。结果 (1)转染干扰SEDL基因病毒的软骨细胞SEDL基因表达明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。Sedlin蛋白表达降低,表明干扰SEDL基因的细胞模型构建成功。(2)随着Sedlin蛋白的减少,II型胶原蛋白表达量降低,具有统计学差异(P<0.05)。(3)细胞模型中内质网分布发生改变,其形态变圆,触角变少,颜色变淡,细胞与细胞间内质网荧光排列不规则,紊乱。(4)电镜下观察,细胞模型中内质网超微结构出现水肿扩张。(5)转染干扰SEDL基因病毒的软骨细胞活性在48 h达峰,之后细胞活性下降,且具有统计学差异(P<0.05)。结论 Sedlin降低影响软骨细胞II型胶原蛋白表达,软骨细胞中内质网形态位置分布及超微结构发生改变,致使软骨细胞活性降低。

SEDL基因及其编码蛋白sedlin在小鼠多种组织中表达研究

目的:研究SEDL基因及其编码蛋白sedlin在小鼠多种组织中的表达。方法:采用Real-TimePCR和Western Blot检测小鼠9种组织中SEDL基因和sedlin蛋白表达水平及1、2、4周龄小鼠骨组织中的SEDL基因及sedlin蛋白表达水平。结果:①所检测小鼠9种组织中均有SEDL基因及对应的sedlin蛋白表达。组织中SEDL基因及sedlin蛋白表达量上有统计学差异(P<0.0001),以骨组织中SEDL基因及sedlin蛋白表达水平高。②不同周龄小鼠骨组织中,SEDL基因及sedlin蛋白的相对表达水平有统计学差异(P<0.01),二者的表达量随年龄变化的趋势相吻合。结论:SEDL基因和sedlin蛋白在所测组织中的表达相一致。二者的表达量在组织间均有差异性,其中以骨组织中表达水平最高。小鼠骨组织中SEDL基因及sedlin蛋白的表达量上有相同时相性改变。

迟发性脊柱骨骺发育不良家系基因诊断及遗传学发病机制分析

目的迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)是一种X-连锁隐性遗传的骨软骨发育不良疾病,主要特征包括非匀称性短躯干型身材矮小及特征性的X线片表现。目前,导致该病的已知致病基因为SEDL基因。该文的主要目的是对一个来自湖南的SEDT家系进行基因诊断和遗传学发病机制分析。方法对一例迟发性非匀称性短躯干型身材矮小的患者进行家系分析和临床诊断;采集患者及其母亲外周血,进行DNA抽提后,对SEDL基因4个外显子的编码区进行PCR扩增;琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否存在及其大小;对未成功扩增的外显子进行长PCR扩增,并对长PCR扩增得到的截短PCR产物进行测序分析。结果患者存在一个大小为1 327 bp的缺失,该缺失包括部分第5内含子和第6外显子编码区;患者母亲为该缺失的携带者。对缺失序列及其侧翼序列进行分析,发现第5内含子存在一个Alu序列,与第6外显子非编码区4个Alu序列序列高度相似;提示这些Alu序列的存在可能是SEDL基因发生类似缺失突变的遗传性发病机制的分子结构基础。结论该文在一个湖南家系中发现的SEDL基因缺失突变,即包括第6外显子编码区在内的1 327 bp缺失,是一个新发现的国际上尚未报道的突变。对SEDL基因的突变检测有助于患者迟发性脊柱骨骺发育不良的确诊,也为女性携带者的诊断,产前诊断和遗传咨询奠定重要的前提基础。

X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系SEDL基因突变分析

目的鉴定中国西南地区一个4代迟发性脊椎骨骺发育不良大家系的分子遗传缺陷。方法采用X染色体荧光标记微卫星标记物进行连锁分析，并通过直接序列分析筛查SEDL基因突变。结果DXS987与DXS8051之间呈现连锁（最大LOD值：3．82；θ=0），致病基因定位于Xp22．2-Xp23．1；序列分析发现SEDL基因第4外显子发生点突变（c．239A〉G），导致在第80位编码氨基酸由组氨酸置换为精氨酸（H80R）。结论SEDL基因与此中国迟发性脊椎骨骺发育不良大家系表型完全连锁，并发现该基因新的致病突变（H80R）。

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因剪接受体突变导致潜在剪接位点激活(英文)

目的深入研究X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(Xlinkedspondyloepiphysealdysplasiatarda,SEDL)的发病机理,为最终防治本病提供依据。方法应用逆转录PCR及克隆测序方法对1例涉及SEDL基因第5内含子剪接受体缺失的SEDL患者进行mRNA表达研究。结果该患者存在2个不同片段长度的mRNA表达产物,与GenBank正常序列进行BLAST比较后发现,393bp的表达产物是第6外显子内一个新的潜在剪接位点激活后形成的产物;433bp的表达产物与8号染色体的部分基因组序列完全一致。结论SEDL基因第5内含子剪接受体位点及其后的第6外显子共13个碱基的缺失突变导致第6外显子内一个新的潜在剪接受体位点激活,使转录后的mRNA丢失了第6外显子内47bp的编码序列,并使紧接其后的2个密码子产生移码,导致翻译的提前终止(D109-S123del;S124fsX126)。另外,该突变可能激活了8号染色体上假基因SEDLP2的转录,从而部分地补偿了SEDL蛋白的功能。

X连锁迟发性脊椎骨骺发育不良SEDL基因突变的分析

目的研究一个X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良（spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT）家系发病的分子遗传学机制，为其家系成员建立遗传咨询和产前诊断的方法。方法应用PCR扩增及DNA测序分析方法，对1家系包括3例SEDT患者在内的7名家系成员SEDL基因的全部编码外显子及其邻近序列进行突变分析。结果在3例SEDT患者及2例携带者中发现了致病突变，并经DNA序列分析证实，SEDL基因第5外显子发生移码突变C．267_271delAAGAC。结论SEDL第5外显子的C．267_271delAAGAC突变为该家系的致病原因。

SEDL基因突变与X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良研究进展

SEDL基因于定位于X短臂(Xp22.2),含有6个外显子,第3～6外显子为编码外显子,翻译起始密码位于外显子3,翻译产物为含有140个氨基酸的Sedlin。SEDL基因是一个高度保守的基因,参与在内质网至高尔基体间囊泡运输的定位和融合,与蛋白质转运有关。X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)是累及脊椎椎体和身体承重大关节的骨软骨发育障碍性疾病,呈X-连锁隐性遗传。临床特点为短躯干性侏儒和进行性的大关节退行性变,X线检查腰部椎体前部上下缘凹陷、中后部呈驼峰状突起。1999年首次发现SEDT的致病基因为SEDL,迄今为止已在SEDL基因上发现47种突变,其中缺失突变最为常见。本文简要综述了SEDL基因的结构与功能以及SEDT的分子遗传学研究进展,有助于SEDT的基因诊断与产前诊断。

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。

X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良家系基因突变研究

目的研究X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良（X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDL）患者的发病机理，并探讨该病的快速基因诊断方法。方法应用逆转录聚合酶链反应，结合序列分析方法，对一个X-SEDL家系2例患者及育龄女性进行SEDL基因突变分析。结果cDNA序列分析显示患者为G209A突变，并对突变所在第4外显子进行PCR扩增并测序进一步证实。患者女儿为该突变的携带者。结论由于SEDL基因较小，直接对患者提取总RNA，逆转录后直接进行PCR扩增、测序，可直接发现基因阅读框内的多种类型的突变，相对于针对每一个外显子单独扩增检测更加直接、快速。