四川地区甜樱桃S基因型及SFB4'基因的分子鉴定

【目的】甜樱桃(Cerasus avium L.)的S基因决定其自交的亲和性。为鉴定四川地区甜樱桃品种的S基因型和高自交亲和性品种,本研究对收集到的39份甜樱桃材料进行S基因型鉴定,并比较SFB4与其自交亲和突变体SFB4'基因的差异。【方法】利用S基因通用引物和特异引物对四川地区种植的39份甜樱桃叶片DNA进行PCR扩增,并对含有SFB4/SFB4'基因的扩增片段进行测序。【结果】39份甜樱桃材料共鉴定出S1、S2、S3、S4、S6、S9等6个基因型,其中27份材料含有S3基因,19份材料含有S9基因,12份材料含有S1基因,11份材料含有S4基因,7份材料含有S6基因,3份材料含有S2基因。根据鉴定得到的S基因型结果,扩增得到含有S4基因的11份材料中的SFB基因的ORF序列,比对结果显示,相比于SFB4,SFB4'在903 bp处存在4个碱基缺失;本研究设计了SFB4'特异引物,测序结果显示,有7份材料的SFB基因型为SFB4'。【结论】共鉴定得到S1、S2、S3、S4、S6、S9等6个基因型,对含有S4基因的11份材料的S4基因全长进行测序,确定7份材料为突变基因SFB4'。本研究为四川地区甜樱桃授粉树配置提供了数据支撑,并为甜樱桃新品种的选育奠定了理论基础。

82份苹果属资源SFB基因克隆及不同生态居群基因频率分析

为了明确不同苹果属资源的SFB基因及在各居群中SFB基因的类型和分布频率,本研究以奎花等栽培苹果及新疆野苹果等野生资源共82份为试验材料,利用3对苹果属SFB基因特异性引物,以叶片DNA为模板进行PCR扩增。特异扩增结果显示:所有试材中均只鉴定出单一的SFB基因片段。经GenBank同源性比较分析,发现这些片段分属5种不同的SFB等位基因,分别为SFB1、SFB2、SFB3、SFB7、SFB9。同时对不同生态种群中SFB基因的分布频率进行了分析,结果表明不同SFB基因出现的频率不同,SFB3出现的频率最高为43.90%,其次为SFB1(39.00%),而相同的SFB基因在不同苹果种间及种内出现的频率亦不同。此外,系统进化树分析显示,新疆野苹果与土库曼苹果及栽培苹果的驯化起源有关。

菠萝SLF/SFB基因家族全基因组鉴定与表达分析

自交不亲和性是高等植物通过抑制自花授粉来阻止近亲繁殖的一种繁殖机制。在以茄科、蔷薇科、车前草科为代表的配子体自交不亲和机制中,花粉和雌蕊之间的自我/非自我识别由多态性S位点决定,其中SLF(S-locus F-box)/SFB(S-haplotype-specific F-box)基因是配子体自交不亲和花粉S决定因子。本研究通过生物信息学方法从菠萝基因组中筛选鉴定出21个SLF/SFB家族基因(AcSLF1~AcSLF21),各AcSLF基因在N端具有F-box保守结构域,其氨基酸长度、理论等电点、分子量存在较大差异,编码氨基酸序列大小范围为242~612 aa,分子量为27.778~69.070 kDa,其中18个AcSLFs蛋白偏碱性,总体蛋白稳定性较差,预测18个AcSLFs蛋白亚细胞定位于细胞核中,蛋白二级结构60%以上由α-螺旋和无规则卷曲组成。通过染色体定位分析发现其不均匀地分布在14条染色体上,其中AcSLF21未定位到具体染色体位置,并发现AcSLF4、AcSLF5、AcSLF6、AcSLF8、AcSLF14和AcSLF15与菠萝RNaseT2家族基因发生连锁。从进化关系中发现,菠萝SLF/SFB家族与蔷薇科、车前科、茄科植物SLF/SFB进化关系较远。利用qRT-PCR对AcSLFs基因在菠萝雌蕊、雄蕊、叶片、果肉、茎和根的表达量进行分析,结果发现AcSLFs基因在菠萝不同组织中具有明显的表达差异性,其中AcSLF1、AcSLF2、AcSLF4、AcSLF9、AcSLF10、AcSLF11、AcSLF15、AcSLF19、AcSLF20、AcSLF21基因在菠萝雄蕊中呈高表达量,AcSLF3、AcSLF7在果肉中表达量最高,AcSLF5、AcSLF12、AcSLF18在根中表达量显著高于其他组织,总体来说,大部分菠萝AcSLFs基因主要在菠萝雄蕊或叶片中高表达。同时分析了雌蕊自花、异花授粉前后的表达变化,发现AcSLF1、AcSLF2、AcSLF15三个基因在授粉雌蕊中的表达量较未授粉显著上调,尤其在授粉6h表达量急剧上调,随着花粉管的伸长其表达量降低,但在授粉24h仍具有较高的表达量,推测这些基因可能在菠萝自交不亲和中起到重要作用。该研究为菠萝SLF/SFB家族基因的克隆提供参考,并为菠萝自交不亲和机制研究奠定良好基础。

桃SFB2m参与S-RNase泛素化降解途径

【目的】自交亲和特性的产生可由多种因素导致,其中S-RNase被泛素化标记后移动到26S蛋白酶体中被降解这一途径,是显现自交亲和的重要原因。探究桃SFBs在S-RNase泛素化降解过程中的作用,为桃自交亲和机制的研究提供参考。【方法】通过生物信息学方法对PpSFBs和PpSLFLs进行基因定位和共线性分析,使用PCR确定PpSFBs在花器官中的特异表达位置,利用BiFC验证PpSFBs与S-RNase的互作后,通过S-RNase体外泛素化实验和寡核苷酸转染沉默PpSFBs实验来探究PpSFBs在S-RNase泛素化降解途径中的作用。【结果】PpSFBs和PpSLFLs无共线性关系;PpS1/2/4-RNase在花柱中特异性表达,PpSFB1m/2m/4m在花粉中特异性表达,PpSLFL1/2/3在不同桃品种中差异性表达,PpSLFL2在龙1-2-4品种中不存在;通过BiFC技术证明,PpS1/2/4-RNase分别与PpSFB1m/2m/4m和PpSLFL1/2/3互作。体外泛素化实验证明,PpSFB2m具有与PpSLFL2相似的功能,能泛素化PpS2-RNase。寡核苷酸转染实验证明PpSFB1m/2m/4m和PpSLFL2/3沉默后可显著抑制花粉管生长。【结论】PpSFB2m在桃花粉管中发挥与PpSLFLs类似的功能,可泛素化标记S-RNase,泛素化的S-RNase移动到26S蛋白酶体中被降解失活,致使桃自交亲和性状的产生。

2个中亚杏品种自交不亲和SFB基因的克隆及序列分析

【目的】为了获得杏中亚生态品种群中自交不亲和花粉特异表达的SFB基因全长,探讨SFB基因序列多态性,【方法】以中亚生态品种群‘馒头玉吕克’和‘索格佳娜丽’2个杏品种为材料,利用RT-PCR及RACE技术和DNAMAN软件分析,克隆得到了2个新的SFB基因的全长cDNA,SFB33(HQ148064)和SFB50(HQ148074)。【结果】SFB33全长1 378 bp,SFB50全长1 313 bp,两个基因开放阅读框均为1 131 bp,编码376个氨基酸;与GenBank上已登录的SFB基因核苷酸序列进行Blast比对,SFB33基因与SFB-c(FJ362527)同源性为79%;SFB50基因与SFB23(EU652886)同源性为99%。在两个基因上均找到F-box区域和两个变异区及两个高变区。李亚科SFB氨基酸序列同源性比对显示SFB50与李亚科其他SFB基因亲缘关系较近,而SFB33与李亚科其他SFB基因亲缘关系较远。【结论】杏中亚生态品种群中SFB基因显示明显的序列多态性。

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。

7个杏李品种花粉SFB基因的克隆鉴定

以美国杏李品种为试验材料,利用Prunus的SFB基因特异性引物,对7个杏李品种进行PCR扩增,并进行克隆、测序。采用生物信息学分析方法分离鉴定了‘恐龙蛋’等7个杏李品种的花粉SFB基因。PCR结果显示,‘风味皇后’、‘味帝’、‘味王’、‘风味玫瑰’、‘味厚’、‘味馨’、‘恐龙蛋’等7个品种均扩增出一条460 bp左右的片段;对PCR产物回收克隆后测序,并通过BLAST比对和生物信息学分析表明,‘风味皇后’、‘味王’、‘风味玫瑰’、‘味厚’、‘味帝’、‘恐龙蛋’等6个品种中克隆到了一个SFBh基因;‘风味皇后’、‘味王’、‘风味玫瑰’、‘味厚’、‘味馨’等5个品种中克隆到了一个SFBe基因;‘味帝’和‘恐龙蛋’中分离克隆了SFBb基因;‘味馨’中分离克隆了一个SFB2基因;故7个杏李品种的花粉SFB基因型鉴定为:‘风味皇后’、‘味王’、‘风味玫瑰’和‘味厚’等4个品种的花粉SFB基因型相同,为SFBeSFBh;‘味帝’和‘恐龙蛋’的花粉SFB基因型相同,为SFBbSFBh;味馨’的花粉SFB基因型为SFBeSFB2。

甜樱桃SFB4与SFB4’基因的鉴别

本研究以最近发现的李属花粉决定子候选基因“S单元型特异F-box蛋白基因(SFB)”为基 础,根据甜樱桃SFB4基因设计引物,从自交不亲和‘雷尼’和‘佳红’以及自交亲和的‘斯坦拉’总 DNA中分别扩增出SFB4和SFB4’基因的部分序列。经测序结果发现:SFB4’基因比SFB4基因缺失了4 个碱基TAAA。根据这个缺失差异,设计了一对引物BFP200和BFP201,这对引物只能扩增SFB4’基因, 而不能扩增SFB4基因,从而利用SFB基因区分开了甜樱桃自交不亲和的S4和自交亲和的S4’单元型。

赛买提杏自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆主栽杏(Prunus armeniaca)赛买提自交不亲和性花粉SFB基因全长序列,为今后通过分子改良培育具有自交亲和性的赛买提杏奠定基础。【方法】通过RT-PCR法克隆获得赛买提杏花粉SFB基因中间片段,RACE技术克隆c DNA全长,DNAMAN预测其氨基酸序列,并将编码蛋白与自交亲和的杏SFBC基因进行比对。【结果】克隆到1个全长为1 373 bp的SFB基因,命名为SFB60(Gen Bank登录中)。该基因包含1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸。与SFBC基因相比,该蛋白有2个变异区(V1和V2)和2个高变区(HVa和HVb),N端有一段由42个氨基酸组成的F-box结构域,而SFBC基因缺少2个高变区。【结论】获得了赛买提杏花粉自交不亲和SFB60基因c DNA全长序列,为进一步以分子育种的方法来改良赛买提杏的研究奠定了基础。

2个野扁桃自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

为给野扁桃的遗传改良和自交不亲和机制的进一步研究提供理论依据,以新疆野扁桃花药为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆野扁桃自交不亲和性花粉特异性决定因子编码基因SFB全长序列。采用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,CDD分析蛋白保守结构域,Prot Param分析蛋白理化性质,TMHMM预测蛋白跨膜区,Signal P预测蛋白信号肽,Sub Loc预测蛋白亚细胞定位,SOPMA分析蛋白二级结构,DANMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA6进行系统进化分析,Prot Fun预测蛋白功能。结果表明:克隆到的Pt SFB16基因和Pt SFB17基因属于F-box基因家族,与其它多种植物的SLF/SFB基因的序列相似度为88%,推导的氨基酸序列均具有F-box蛋白典型结构;Pt SFB16基因ORF长1 146 bp,编码381个氨基酸,Pt SFB17基因ORF长1 131 bp,编码376个氨基酸;预测2个SFB蛋白均为略显亲水性、不稳定的细胞质蛋白,二级结构均以α-螺旋,延伸链和无规则卷曲为主,SFB/SLF蛋白在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,种间同源性可能大于种内同源性,SFB蛋白可能的功能主要有辅助因子生物合成、能量代谢和裂合酶。

扁桃花粉SFB基因的鉴定和序列分析

以新疆栽培扁桃品种"石头"花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得了一个全长的SFB基因(Genbank登录号为:FJ415321),命名为AcSFBg。该基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序,含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2)。组织特异性表达分析表明:AcSFBg基因仅在花药中表达,雌蕊、花瓣以及叶片等组织中没有表达。F-box基因系统发育树的构建,发现在桃属不同种之间的SFB基因出现了交叉的现象,但与矮牵牛和金鱼草SLF基因具有比较远的亲缘关系。同时利用生物信息学的方法成功预测了AcSFBg蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起连接酶和主要中间产物新陈代谢的重要作用。结果表明:获得的AcSFBg基因就是花粉S决定子,也将为花粉自交不亲和机制的研究提供重要的理论依据。

‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建

【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。

新疆野扁桃自交不亲和花粉SFB基因的克隆及生物信息学分析

旨在克隆获得新疆野扁桃自交不亲和花粉SFB新基因,以新疆野扁桃花药为试材,应用分子同源克隆及RT-PCR等技术,并进一步采用在线软件分析SFB基因的蛋白质理化性质,实验成功克隆到了PtSFB5与PtSFB6 2个新SFB基因的cDNA全长,2个基因的cDNA全长分别为1124 bp和1072 bp,分别编码了374和348个氨基酸,2个基因都具有F-Box基因结构,属于F-Box基因家族,预测的相对分子量分别为30787.26和44037.74,等电点为5.93和5.43,均属于水溶性不稳定蛋白。

果梅自交不亲和相关基因型(S、SFB/SLF)研究进展

果梅(Prunus mume Sieb.etZucc.)原产于中国,为蔷薇科典型的配子体自交不亲和(GSI)品种。GSI至少由S位点的花柱S(S-RNase)基因和花粉S(SFB/SLF)基因决定。主要介绍了果梅GSI决定基因S基因和SFB/SLF基因的研究现状,并对基因型的鉴定技术AS-PCR的理论基础进行了介绍,对目前国内外已经鉴定出基因型的果梅品种进行了总结,这些将对果梅品种授粉树的合理配置和杂交育种的亲本选择具有重要的意义。

果树自交不亲和SFB与S-RNase作用分子机制研究进展

综述了蔷薇科果树自交不亲和性分子机制的相关研究进展,对果树自交不亲和关键基因SFB与S-RNase的生物合成与表达,序列结构特点及对应功能、作用机理及其在花柱传输组织中的相互作用等方面进行了总结,并在此基础上提出了改进修正抑制子假说的相互作用机理,以期为开展果树自交不亲和分子机制的深入研究提供基础资料。

‘小白杏’自交不亲和SFB基因的克隆及其表达载体的构建

【目的】利用基因工程技术改良杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】以新疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca L.‘Xiaobaixing’)的花粉为材料,通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)和3’RACE(Rapid Amplification of c DNA Ends)技术克隆SFB基因(S-haplotype-specific F-box protein)片段。以克隆载体p MD19-T为基础,结合p BS-T上的酶切位点,利用酶切连接的方法将SFB基因的ORF框正向重组到表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的Kpn I和Sac I酶切位点之间,构建SFB基因正义表达载体p CAMBIA-S-SFB;将SFB基因的ORF框反向重组到表达载体的Kpn I和Sal I酶切位点之间,构建SFB基因反义表达载体p CAMBIA-A-SFB;用电击转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】通过RT-PCR和RACE技术获得了1136 bp SFB基因片段(Gen Bank登录中),其中含912 bp ORF框(Open Reading Frame),由它推导的氨基酸序列与蔷薇科SFB基因高度同源,具有F-box结构域、2个变异区和2个高变区的完整结构;表达载体酶切检验结果表明,SFB基因的ORF框正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,表明SFB基因的正、反义表达载体构建成功;特异引物PCR验证结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究的结果为利用基因工程技术改良杏自交不亲和性状、培育自交亲和杏品种的遗传转化提供了载体。

新疆野扁桃自交不亲和SFB与S-RNase蛋白间相互作用的研究

利用酵母双杂交系统研究新疆野扁桃自交不亲和性花粉SFB蛋白与花柱S-RNase蛋白间的相互作用。以野扁桃花药为实验材料,根据实验要求和基因的结构特点,利用已克隆到的SFB和S-RNase基因,有针对性的截短,构建酵母双杂交载体。研究结果显示,成功构建了酵母双杂交重组表达载体,PtSFB17、PtS16-RNase和PtS17-RNase各蛋白之间并没有发现存在相互作用,据此推测PtS16-RNase蛋白和PtS17-RNase蛋白不在PtSFB17蛋白的识别谱中,协同非我识别模型在新疆野扁桃中同样存在。新疆野扁桃自交不亲和性PtSFB17、PtS16-RNase和PtS17-RNase各蛋白间并无相互作用。

基于RTDS小电流接地系统主要故障条件的暂态SFB分量分析

为多方面检验暂态法小电流接地选线装置性能的效果及对检验结果进行理论分析做准备,介绍了基于暂态SFB分量的选线方法,利用实时数字仿真器(RTDS)建立小电流接地系统仿真平台,设置故障时刻、故障过渡电阻、谐波含量、故障位置、故障稳定程度5种类型条件的故障进行仿真试验,分析各类型条件变化对暂态SFB分量的影响。仿真结果得出各种故障条件下选线方法的适用性,证明建立的仿真平台适于该类装置的检验。

毛桃11-21的SFB/SLF基因全长克隆与分析

为进一步明确桃自交亲和性机制,对毛桃11-21的SFB/SLF基因进行全长克隆,共克隆得到2条SFB序列和1条SLF序列。SFB/SLF基因与其他李属F-box基因的核苷酸序列和氨基酸序列都具有较高的同源性。序列分析发现,试验克隆的2个SFB基因序列由于核苷酸片段插入或者序列异常导致翻译提前终止,因此氨基酸序列异常,其中Pp SFB2更是缺失了C端的V2,HVa和HVb。毛桃11-21的Pp SLF1基因能正常翻译,没有提前终止,该基因编码的蛋白序列具有典型李属F-box蛋白结构,与其他李属果树氨基酸序列具有较高的一致性,而与梨属果树氨基酸同源性较低。系统进化分析表明,桃SFB基因与李和杏的同源性较高,而3个桃SFB基因间的同源性较低。李属SLF基因与梨属果树的亲缘关系则较远,而桃SLF基因与其他李属果树关系也较远。