Construction of A Non-Redundant Human SH2 Domain Database

Domain database is essential for domain property research. Eliminatingredundant information in database query is very important for database quality. Here we report themanual construction of a non-redundant human SH2 domain database. There are 119 human SH2 domains in110 SH2-containing proteins. Human SH2s were aligned with ClustalX, and a homologous tree wasgenerated. In this tree, proteins with similar known function were classified into the same group.Some proteins in the same group have been reported to have similar binding motifs experimentally.The tree might provide clues about possible functions of hypothetical proteins for furtherexperimental verification.

SH2D4A互作蛋白的筛选及初步鉴定

SH2D4A是SH2蛋白家族成员之一,可能参与酪氨酸蛋白激酶相关受体介导的信号转导,调节细胞的生长、增殖和分化,进而影响人类疾病的发生。文章运用酵母双杂交技术筛选SH2D4A相互作用蛋白,并利用酵母交配(mating)实验和GST pull-down实验进行了初步鉴定。首先成功构建了酵母诱饵蛋白重组表达载体pGBKT7-SH2D4A;利用该重组体对人肾脏cDNA文库进行逐级筛选,共得到46个阳性克隆;经目的基因的分离、DNA测序及BLAST软件对序列进行比对分析,发现5种可能的SH2D4A互作蛋白(AZGP1、DAD1、HSD17B10、KAT5和PKM2);NetPhos 2.0 Server软件预测结果显示除HSD17B10外其他4种蛋白均含有磷酸化酪氨酸;进一步以KAT5和HSD17B10作为代表进行了酵母交配和GST pull-down,证实两者均可直接结合SH2D4A。

重组腺病毒AdE-SH2-Caspase8对耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响

目的:研究表达融合蛋白SH2-Caspase 8的重组腺病毒Ad E-SH2-Caspase 8-HA-GFP(SC)对BCR/ABL阳性的耐伊马替尼的K562/G01细胞凋亡的影响。方法:K562/G01细胞经重组的腺病毒SC感染后,分别设突变Ad E-SH2m-Caspase 8-HA-GFP(Sm C)组、病毒空载Ad EGFP(CM V)组和PBS对照组。荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测病毒感染效率,Western blot检测融合蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达水平,光学显微镜观察经瑞氏染色后的细胞形态,FCM和DNA梯度电泳检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3和PARP的表达水平。结果:重组腺病毒在K562/G01细胞中的感染效率较高;Western blot能检测到目的蛋白SH2-Caspase 8-HA的表达;与对照组比较,瑞氏染色后SC组出现明显的凋亡形态改变,FCM检测结果表明SC组早前凋亡细胞明显增高(P<0.05),DNA梯度电泳检测结果发现SC组出现明显细胞凋亡特异性的梯度条带,Western blot结果表明SC组凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP活化片段的表达水平升高。结论:重组腺病毒SC表达的SH2-Caspase 8融合蛋白能明显诱导K562/G01细胞的凋亡。

SH2域与磷酸化多肽相互作用的连续溶剂模型研究

使用连续溶剂模型方法研究了SH2结构域与磷酸化多肽pYXXX(X为20种常见氨基酸残基中的任意一种)之间的相互作用.首先计算了已知的SH2域-磷酸化酪氨酸多肽复合物之间的结合能,理论计算的结果与实验测得的亲合能之间的相关系数为0.91,验证了理论模型的正确性.然后,用该模型方法计算了SH2域与pYXXX之间的结合能,分析了磷酸化酪氨酸多肽pYXXX中+1,+2,+3位置上残基对结合能的影响.结果表明+2,+3位置上残基的变化对结合能影响较大,+2位置上带负电的残基和+3位置上的疏水性残基有利于SH2域与pYXXX之间的相互作用,这与实验结果一致.

SH2-ODC/AZ1腺病毒的构建及对BCR-ABL蛋白的降解效应

目的构建重组腺病毒Ad-SH2-ODC和Ad-AZ1,检测共表达SH2-ODC和AZ1蛋白对BCR-ABL癌蛋白的降解效应。方法PCR扩增src同源结构域2(src homology 2,SH2)、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)及抗酶蛋白1(antizyme 1,AZ1)基因,构建携带SH2-ODC(SO)或AZ1基因的p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒,经双酶切和测序鉴定后与腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1同源重组,获得重组腺病毒质粒。后者经PacⅠ酶切鉴定后,在人胚肾细胞系AD293中包装、扩增,获得重组腺病毒;腺病毒Ad-SO和Ad-AZ1共感染人白血病细胞系K562,western blot检测目的蛋白的表达。结果双酶切和测序证实,腺病毒穿梭质粒构建正确;PacⅠ酶切结果显示,重组腺病毒质粒构建成功;western blot证实目的蛋白在K562细胞中表达正确,共表达SO和AZ1可以降低BCR-ABL蛋白水平。结论成功构建了Ad-SO和Ad-AZ1重组腺病毒,共表达SO和AZ1可以降解K562细胞中的BCR-ABL蛋白。

SHP-2蛋白NSH2结构域的原核表达和同位素标记

SHP-2蛋白是一种含有两个SH2结构域的磷酸酶。SHP-2的N端SH2结构域是细胞因子或病毒因子激活该蛋白的分子内靶点。对shp2基因进行信息学分析,设计引物通过PCR克隆出人SHP-2蛋白N端SH2结构域(NSH2)的DNA序列。重组到原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效率表达了可溶性NSH2蛋白。对蛋白进行15N同位素标记和纯化,并浓缩获得达到进行核磁滴定法结构研究的蛋白样品。

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

目的:探讨Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法。方法:将Grb7蛋白SH2结构域编码基因与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签编码基因构建为融合基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点EcoRⅠ与XhoⅠ之间,挑选测序正确的质粒将其转染至BL 21感受态细胞内,感受态细胞于37℃摇培至其OD值达到0.6～0.8后,经0.2 mmol/L IPTG 25℃过夜诱导表达融合蛋白,MALDI-TOF质谱检测蛋白纯化产物,SPR生物传感器(Biacore 3000)检测纯化蛋白与天然配体磷酸化肽段的相互作用。结果:GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白在裂解菌液的上清液中存在,500 ml LB/Amp菌液可纯化得到415μg GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,MALDI-TOF质谱图上可见明显目的蛋白峰,Biacore 3000检测到纯化蛋白可结合不同浓度的磷酸化肽段配体。结论:运用改进的GST融合蛋白纯化方法可得到具有一定纯度及生物学活性的GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,为该蛋白结构域后续功能研究奠定了基础。

干扰素α-1b联合人免疫球蛋白对EB病毒感染患儿临床疗效及对Ficolin-3、SH2D1A表达的影响

目的探讨人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗对EB病毒(EBV)感染患儿的临床疗效,并分析治疗对患儿免疫相关分子纤维胶凝蛋白3(Ficolin-3)、SH2结构域蛋白1A(SH2D1A)表达水平的影响。方法选取2018年2月至2020年2月在该院就诊的130例EBV感染患儿,根据治疗方式不同分为对照组和观察组,各65例。对照组给予常规治疗,观察组在常规治疗基础上给予人干扰素α-1b联合人免疫球蛋白治疗。观察两组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失时间。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测治疗前后两组EBV-DNA、EBV-CA-IgM及EBV-NA-IgG,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组治疗前后血清Ficolin-3、SH2D1A水平,以及外周血白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)。结果观察组发热、咳嗽、颈淋巴结肿大、咽痛、扁桃体肿大和肝脾肿大各项临床症状的消失或消退时间均短于对照组,EBV-DNA、EBV-CA-IgM转阴率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与治疗前比较,治疗后两组Ficolin-3、SH2D1A、IL-6、IL-8、TNF-α、CD8^(+)明显降低,CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗前Ficolin-3、SH2D1A表达与IL-6、IL-8、TNF-α及CD8^(+)呈正相关(r=0.478、0.454、0.503,0.462、0.443、0.511,均P<0.001),与CD3^(+)、CD4^(+)及CD4^(+)/CD8^(+)呈负相关(r=-0.567、-0.402、-0.423,-0.477、-0.416、-0.409,均P<0.001)。观察组治疗总有效率[96.92%(63/65)]明显高于对照组[80.00%(52/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.119,P=0.003),并发症总发生率[9.23%(6/65)]明显低于对照组[30.77%(20/65)],差异有统计学意义(χ^(2)=9.423,P=0.002)。结论干扰素α-1b联合人免疫球蛋白能降低EBV感染患儿Ficolin-3、SH2D1A水平,改善患儿免疫功能,提高治疗有效性。

SH2结构域2A在胰腺癌中的表达及对其吉西他滨耐药的影响

目的探讨SH2结构域2A(SH2D2A)对胰腺癌(PDAC)吉西他滨(GEM)耐药的影响。方法利用Kaplan-Meier Plotter和GEPIA平台探讨SH2D2A在PDAC的表达,对PDAC患者总体存活率(OS)和无病生存期(DFS)的影响;选取郑州大学人民医院手术切除的40例PDAC组织和癌旁组织,蛋白质印迹法(Western blot)分析组织中SH2D2A蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blot分析购自上海细胞典藏委员会的人正常胰腺导管上皮细胞HPDE、人胰腺癌细胞系SW1990、MIA PaCa-2、PANC-1、HPAFⅡ和BxPC-3中SH2D2A蛋白和mRNA表达水平;短发卡RNA(shRNA)构建稳定敲低SH2D2A细胞株,分为实验组(Sh组)和对照组(NC组);qPCR和Western blot分析两组细胞SH2D2A的表达水平;细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞的药物半数抑制浓度(IC50);集落形成实验、CCK-8、流式细胞术和肿瘤成球实验分析GEM处理后细胞的增殖、凋亡和肿瘤干性;组间数据比较采用t检验。结果生信分析显示SH2D2A高表达患者的OS、DFS明显缩短(P均<0.01)。PDAC组织中SH2D2A蛋白表达高于癌旁组织[0.88±0.27比0.36±0.07,t=6.416,P<0.05]。SW1990、MIA PaCa-2、PANC-1、HPAFⅡ和BxPC-3中SH2D2A表达水平高于HPDE[mRNA:5.86±0.45、3.47±0.27、4.74±0.37、2.38±0.18、2.54±0.20比1.00±0.08,t=15.780、12.280、14.490、9.040、9.632,P均<0.05;蛋白:2.24±0.11、1.67±0.07、1.81±0.18、1.31±0.08、1.53±0.17比1.00±0.01,t=18.110、16.400、7.320、6.406、5.220,P均<0.05]。Sh组SH2D2A表达水平低于NC组[mRNA:0.15±0.03、0.14±0.03比1.01±0.07,t=17.970、18.570,P均<0.05;蛋白:0.35±0.02、0.30±0.02比1.00±0.08,t=11.690、14.300,P均<0.05]。Sh组IC50低于NC组[18.27±0.04、16.54±0.10比25.81±0.32,t=45.280、54.850,P均<0.05];Sh组细胞第4天的吸光度值低于NC组[1.20±0.06、1.02±0.08比2.22±0.08,t=17.440、18.490,P均<0.05];Sh组细胞集落数量低于NC组[367.70±31.50、331.00±58.66比738.00±101.50,t=7.211、9.676,P均<0.05];Sh组细胞凋亡比例高于NC组[(28.59±3.44)%、(22.68±1.78)%比(17.67±0.38)%,t=5.166、4.375,P均<0.05];Sh组细胞成球大小小于NC组[8.79±1.43、7.63±1.23比45.31±11.85,t=4.772、5.191,P均<0.05]。结论SH2D2A在人PDAC中表达上调,并参与调控PDAC对吉西他滨的耐药。

快速构建蛋白质结构域克隆库的方法

对蛋白质组学的研究有许多不同的切入方法 .从研究的生物学意义和可行性考虑 ,提出从蛋白结构域入手进行蛋白质组学研究 .SH2 (Srchomology 2 )结构域是细胞信号转导中重要的元件之一 ,人SH2结构域共有约 12 0种 ,对其进行研究将深刻揭示细胞信号转导的规律 .为了得到人所有的SH2结构域序列及克隆 ,首先在公共数据库里检索出了人所有的SH2结构域序列 ,利用国际上现有的共享资源IMAGE(IntegratedMolecularAnalysisofGenomesandTheirExpression)克隆为PCR模板 ,解决了从cDNA文库中难以克隆低丰度结构域的问题 .利用有方向性的TOPO克隆技术提高克隆效率 ,从而快速高效地构建了包括 6 0个SH2结构域的克隆库 .克隆库可以方便地转换到GATEWAY系统具有各种用途的载体上 。

SHIP2在喉鳞状细胞癌中的表达及意义

目的探讨含SH2结构域的Ⅱ型5’肌醇磷酸酶2(SH2 domain containing 5’-inosi-tol phosphatase-2,SHIP 2)蛋白在喉鳞状细胞癌(喉鳞癌)组织中的表达及与临床病理特征和预后的关系。方法应用免疫组织化学技术检测SHIP2蛋白在54例喉鳞癌组织及16例喉癌旁黏膜组织中的表达。结果 SHIP2蛋白在喉鳞癌组织中表达显著升高,其表达与喉鳞癌T分期、临床分期、转移及复发密切相关(P<0.05);生存分析表明SHIP2高表达组与低表达组患者5年无瘤生存率分别为19.2%和64.3%,5年总生存率分别为26.9%和85.7%,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素分析示SHIP2表达水平为喉鳞癌预后的独立影响因素。结论 SHIP 2蛋白可能在喉鳞癌的发生、发展中发挥了重要作用,且具有预后评估价值。

SHP1表达与慢性粒细胞白血病进展的初步研究

目的:探讨SHP1表达与CML急变的关系;构建SHP1真核表达载体.方法:应用RT-PCR比较慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平;SHP1真核表达载体pcDNA3.0-SHP1的测序,检测其mRNA和蛋白表达.结果:急变期患者SHP1转录本水平明显下降,与正常对照间存在统计学差异;pcDNA3.0-SHP1转染K562细胞,可表达SHP1mRNA和蛋白.结论:SHP1的表达下调可能与CML由慢性期朝加速/急变期演化过程有关;成功构建了SHP1真核表达载体pcDNA3.0-SHP1.

SHIP和Caspase-3mRNA在骨髓增生异常综合征患者骨髓组织中的表达及其临床意义

目的:检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓组织中SHIP、Caspase-3mRNA的表达,探讨其表达与MDS发病及向白血病转化过程的关系。方法:根据国际预后评分系统(IPSS)选择62例MDS患者,其中低危(low-risk)组20例、中危1(Int-1)组12例、中危2(Int-2)组13例和高危(high-risk)组17例,采用RT-PCR法检测62例MDS患者及30例健康正常者(对照组)骨髓单个核细胞(BMNC)中SHIP mRNA及Caspase-3mRNA的表达水平,并分析两者之间的关系。结果:MDS低危组和中危1组BMNC中SHIP mRNA表达率(100%,100%)及表达水平(4.467±2.899,4.529±1.975)分别与对照组(100%,4.623±2.979)比较差异均无统计学意义(P>0.05);在中危2组和高危组中,BMNC中SHIP表达率(92%,88%)下降,表达水平(2.124±1.880,2.574±1.807)低于对照组(P<0.05)。Pearson相关分析,MDS患者BMNC中SHIP mRNA与Caspase-3mRNA表达水平呈正相关关系(r=0.714,P<0.05)。随骨髓原始细胞比例升高,SHIP mRNA表达水平降低(F=3.7,P<0.05),不同性别(t=0.940,P>0.05)、不同年龄(t=1.419,P>0.05)患者SHIP mRNA表达水平差异无统计学意义。结论:SHIP在高危MDS患者BMNC中呈低表达或不表达,其表达水平可以作为判定MDS预后的一个指标。

慢病毒介导的SHP-1过表达抑制模型小鼠动脉粥样硬化

目的:研究含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶-1(SHP-1)慢病毒载体在动脉粥样硬化模型小鼠中的作用。方法:将45只8周龄雄性Apo E基因敲除小鼠随机分为3组,即对照组、绿色荧光蛋白(GFP)转染组、SHP-1转染组。3组小鼠右侧颈总动脉植入套环并高脂喂养8周,随后分别转染GFP空载体和SHP-1慢病毒(SHP-1-LV)。分别于转染第1、2、6周检测硬化斑块荧光强度、小鼠体重、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平变化,并利用real-time PCR和Western blot检测右侧颈总动脉中SHP-1、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9等的表达,最后制作切片染色观察斑块病理变化。结果:荧光显微镜下观察到慢病毒转染第1、2、6周后斑块有明显荧光,且在第2周时荧光强度最高,SHP-1慢病毒转染对小鼠体重和血清TC、TG水平无显著影响,但可显著上调右侧颈总动脉中SHP-1的mRNA和蛋白的表达,同时抑制IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9等的表达水平。SHP-1慢病毒转染也降低右侧颈总动脉斑块面积比及脂质含量。结论:过表达SHP-1可能促进小鼠动脉粥样硬化斑块消退,从而为预防和治疗动脉粥样硬化提供靶点。

胰岛素受体底物家族成员的结构和组织特异性与功能的关系

胰岛素(insulin)/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)信号通路在细胞的分化、生长、生存及代谢起非常重要作用。胰岛素信号传递首先需要胰岛素/IGF-1与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合,磷酸化胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IR Ss)后形成一个紧密连接的三聚物。磷酸化的IRSs作为停靠蛋白(docking protein)再激活一系列包含Src同源结构域2(SH2)的蛋白,引起相应的生物学效应。目前发现IRSs从IRS-1到IRS-6共6种,它们的分布存在明显的组织特异性,IRS-1、2在人体多种组织中分布广泛;IRS-3则在脂肪组织中居多;而IRS-4、5、6在人体组织表达相对较低。本文拟对IRSs在组织中分布特异性与功能作一综述。

SHIP1调控STAT3信号通路对白血病Jurkat细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP1)通过调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对人白血病细胞活力和凋亡的影响。方法:以白血病Jurkat细胞为研究对象,将转染空载体和SHIP1过表达载体的细胞分别记为阴性对照(NC)组和SHIP1组,同时以不作处理的细胞为空白对照(control)组,用real-time PCR和Western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白水平。同时,用STAT3信号通路抑制剂AG490作用于control组和SHIP1组细胞,分别记为control+AG490组和SHIP1+AG490组,再观测上述指标的变化。结果:分别与control组和NC组比较,SHIP1组SHIP1的mRNA表达水平和蛋白水平均显著升高(P<0.05);细胞存活率显著降低(P<0.05);细胞凋亡率显著升高(P<0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05)。分别与control组和control+AG490组比较,SHIP1+AG490组的细胞存活率显著降低(P<0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P<0.05);细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:SHIP1能够通过抑制STAT3信号通路抑制人白血病细胞生长,促进白血病细胞凋亡。

慢性髓系白血病患者SHP-1基因、id4基因甲基化状态及其与疾病进展的关系

目的探究慢性髓系白血病(CML)患者含SH2结构域的磷酸酶1(SHP-1)基因、DNA结合抑制因子4(id4)基因甲基化状态及其与疾病进展的关系。方法选取2015年5月—2019年5月中国人民解放军联勤保障部队第九六四医院血液科收治CML患者78例为研究对象(病例组),选取同期于医院健康体检者42例作为健康对照组。使用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)法对2组受试者骨髓中SHP-1基因、id4基因甲基化表达进行检测,分析CML患者慢性期、加速期及急变期SHP-1基因、id4基因甲基化率。结果SHP-1、id4基因mRNA表达水平比较,健康对照组>慢性期>加速期>急变期,差异均有统计学意义(F=83.813、424.699,P均=0.000)。健康对照组、CML慢性期、加速期及急变期的SHP-1基因甲基化阳性率分别为0%、25.00%、96.67%及100.00%,差异具有统计学意义(χ^2=98.127,P=0.000);而id4基因甲基化阳性率分别为0%、0%、66.67%及70.83%,差异亦具有统计学意义(χ^2=65.490,P=0.000)。结论SHP-1基因、id4基因在健康者中呈非甲基化,在CML慢性期甲基化率较低,在加速期或急变期则呈高甲基化状态,因而其甲基化可作为预测CML疾病进展的标志因子,对CML的诊断及治疗具有积极意义。

SHCBP1与恶性肿瘤研究进展

SHC SH2结合蛋白1作为细胞表面受体衔接蛋白的一种,能激活多种信号分子从而发挥一系列生理功能。跟踪近年SHCBP1参与细胞周期调控发挥促癌作用相关研究报道,总结了SHCBP1在常见恶性肿瘤中的研究现状,分析SHCBP1在肿瘤细胞周期调控中可能作用的分子机制。研究成果可为肿瘤发病的分子机制提供理论基础,为研发抗肿瘤的SHCBP1分子药物提供参考。

SHCBP1在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的研究SHCBP1基因在人肝癌组织中的表达情况,探讨SHCBP1基因在肝细胞癌发生发展中的作用。方法采用半定量RT-PCR、荧光定量PCR(时实PCR)、免疫组织化学法等方法检测SHCBP1基因在52例临床肝细胞癌样本的癌及癌旁组织和人正常组织的表达情况,应用统计学方法分析结果。结果①SHCBP1基因mRNA表达水平在人正常组织中表达具有明显差异;在肝细胞癌样本中明显高于癌旁组织(P<0.05);②免疫组化结果检测显示SHCBP1蛋白在癌旁组织组织中低表达或不表达,而在肝细胞癌组织中表达明显增高,且棕色染色区域主要集中在肿瘤细胞边缘细胞膜位置;③Western blot检测结果显示SHCBP1蛋白在肝细胞癌样本中高表达,癌旁组织中不表达或低表达(P<0.05);④临床统计资料分析显示SHCBP1基因的表达情况与肝细胞癌患者的性别、年龄、临床分期无关,而与肿瘤的直径大小、个数、分化程度、脉管浸润紧密相关。结论 SHCBP1基因在肝细胞癌组织中呈高表达,可能通过影响多种癌症信号通路分子促进肝癌的发生发展,同时该基因可能成为肝癌治疗的潜在新靶点。

重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体的构建与鉴定

目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响。方法设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经PmeⅠ酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF,PacⅠ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定。重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用。结论已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础。