产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中SHV型β内酰胺酶的分子生物学研究

目的 :了解复旦大学附属华山医院临床分离产超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs)大肠埃希菌中SHV型 β内酰胺酶的分布、流行情况以及分子生物学特点。方法 :用SHV型 β内酰胺酶基因的通用引物进行聚合酶链反应 (PCR)检测 ;编码框以外设计引物、PCR扩增SHV型 β内酰胺酶全编码基因并进行克隆表达、序列分析 ;对产SHV型 β内酰胺酶的菌株进行脉冲场凝胶电泳 (PFGE)检测。结果 :5 8株产ESBLs大肠埃希菌中 ,只有 3株细菌产生SHV型 β内酰胺酶 (5 .2 % ) ,其中 1株产生SHV 1 1(非ESBLs) ,另 2株产生SHV 1 2 (ESBLs) ;3株产SHV型 β内酰胺酶菌株的PFGE谱型不同。 结论 :临床分离产ESBLs大肠埃希菌中 ,SHV型 β内酰胺酶的基因型为SHV 1 1和SHV 1 2 ,SHV型ESBLs不是主要的ESBLs型别。未发现产SHV型

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶特性的研究

目的研究SHV-12型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的特性。方法将b laSHV-12基因连接至pET28 a载体上,并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达,挑选b laSHV-12阳性表达的菌落,提取其酶蛋白进行等电点测定和酶动力学分析。结果SHV-12型ESBL等电点为8.2。同时,在所测的几种抗生素中,该酶对头孢他啶和头孢噻肟的Km相同且最小;对头孢噻吩,有着最大的Vm ax/Km;而对阿莫西林,表现出最大的Km和最低的Vm ax。结论SHV-12型ESBL对头孢他啶和头孢噻肟具有高的亲和力,而对头孢噻吩有最大的催化效能。

焦磷酸测序检测产ESBLs革兰阴性菌的SHV基因型

目的探讨一种快速、准确检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)革兰阴性菌的ESBLs基因分型方法。方法双纸片法确定产ESBLs的临床分离菌,聚合酶链反应(PCR)扩增ESBLs的SHV基因片段,用焦磷酸测序技术对29株成都市区临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌进行SHV基因分型研究,检测SHV基因片段中编码35位氨基酸和编码43位氨基酸位点的基因多态性。同时,采用纸片扩散法进行药物敏感性试验。结果焦磷酸测序发现,本地区分离出的29株产ESBLs临床分离菌有21株扩增出SHV基因片段,且在43位氨基酸密码子均没有多态性,35位密码子有基因多态性,核苷酸由T突变为A,亮氨酸变为谷氨酰胺,突变发生率达到42.9%(9/21)。29株产ESBLs的菌株对亚胺培南全部敏感;对头孢西丁、头孢吡肟、头孢他啶耐药率分别为:大肠埃希菌29.4%、11.8%、41.2%;肺炎克雷伯菌50.0%、8.3%、33.3%;对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛和复方磺胺甲口恶唑的耐药性较高,均达到75%以上,对其他药物均有不同程度的耐药性。结论焦磷酸测序技术可快速对临床分离菌产生的ESBLs耐药基因分型,具有准确、快速、实时和高通量等优点。

SHV型超广谱β-内酰胺酶的研究进展

产巯基变量(SHV)型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)已逐渐成为革兰阴性杆菌一个至关重要的耐药机制。产SHV型ESBLs菌株的出现与传播给临床抗感染治疗带来沉重负担,该酶已引起临床和科研工作者的高度重视。本文就SHV型ESBLs的流行情况、耐药机制及检测方法作一概述。

SHV型β-内酰胺酶的动力学研究

采用分光光度法研究革兰氏阴性菌产生的 4种 SHV型β-内酰胺酶的动力学。以 L - B作图法求取 Km和 Vmax。除 SHV- 1对第三代头孢菌素头孢噻肟没有水解作用外 ,SHV型β-内酰胺酶对青霉素类、第一代、第二代、第三代头孢菌素均有不同程度水解作用。头孢噻肟对 SHV- 2、SHV- 4、SHV- 5有较高的亲和力(低 Km) ,但 Vmax均不超过 15 % ,SHV型酶的最适 p H值为 6 .6～ 7.4;最适反应温度是 34～ 40℃。

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.

SHV型β-内酰胺酶的研究进展

目的细菌对β内酰胺抗生素耐药主要是产生一种或多种β内酰胺酶。肠杆菌主要产生SHV型β内酰胺酶,最初报道的SHV型β内酰胺酶的水解底物谱很窄,但SHV-Ⅰ源性的酶通过不断的点突变,拓宽了酶活性谱或增强了耐受β内酰胺酶抑制剂的能力。本文就SHV型β内酰胺酶家族的起源、进化、酶的特性、结构和可能的构效关系作一综合介绍。

鸡福氏志贺菌SHV-12型ESBLs基因的扩增、原核表达及酶特性研究

对5株鸡福氏志贺菌产SHV-12型ESBLs基因进行重组表达并优化表达条件,观察了表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶特性。结果表明:构建的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切后,可切下目的条带。重组质粒转化BL21后所表达的重组蛋白有超广谱β-内酰胺酶活性。SHV-12原核表达的最佳条件是IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度37℃、诱导时间5 h;SHV-12型ESBLs亲和力最强的底物是头孢噻呋钠,Km值为1.29μmol,较难水解的底物是头孢曲松钠,Km值为24.13μmol;它唑巴坦、舒巴坦对头孢曲松钠的抑酶保护率分别为21.01%、25.51%,对头孢噻呋钠的抑酶保护率分别为34.99%、35.49%。

鸡福氏志贺菌产超广谱β-内酰胺酶SHV-12和TEM-1V基因的重组表达及酶特性

通过PCR扩增获得鸡福氏志贺菌产超广谱β-内酰胺酶SHV-12和TEM-1V型ESBLs基因片段,定向克隆入质粒载体构建重组质粒,酶切和DNA测序鉴定后转化受体菌BL21,用SDS-PAGE电泳观察目的基因在重组菌中的表达,用双紫外分光光度仪测定表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶作用。结果表明,构建的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切后,可切下目的条带;DNA测序发现插入片段与SHV-12和TEM-1V ESBLs基因序列完全一致。重组质粒转化BL21所表达的重组蛋白有超广谱β-内酰胺酶活性。重组菌S-BL21、T-BL21的最优表达条件分别是IPTG浓度0.5、0.8mmol/L,诱导温度37℃、37℃,诱导时间5、4h。SHV-12和TEM-1V型ESBLs能水解青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、头孢曲松和头孢噻肟;对头孢噻呋钠的Km值最小,分别为4.9和1.29;对头孢曲松钠的Km值最大,分别为53.43和24.13;抑制剂舒巴坦钠、它唑巴坦钠对SHV-12和TEM-1V型ESBLs水解抗生素有不同程度的抑制作用。

SHV、TEM基因介导的铜绿假单胞菌产超广谱β-内酰胺酶的检测

目的 了解铜绿假单胞菌超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)的产生情况及基因型别 ,并寻求一种适合临床使用的检测铜绿假单胞菌产超广谱 β 内酰胺酶的方法。 方法 使用PCR法和NCCLS推荐的表型确证试验检测 2 0株多重耐药的铜绿假单胞菌的ESBLs。 结果 PCR法共检测出 15株TEM型ESBLs,其中 1株同时携带有SHV基因组。用NCCLS推荐的表型确证试验未检出ESBLs。 结论 我院临床分离株铜绿假单胞菌产ESBLs多为TEM型 。

SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究

目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHV-4酶进行特性研究。方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L,于37℃培养6h。培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2+亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析。结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6mol/L,Kcat为258s,Kcat/Km为9.88×107mol-1·s-1·vL。结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件。

鲍曼不动杆菌SHV-12型超广谱β内酰胺酶基因研究

目的 分析自临床分离的产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)鲍曼不动杆菌SHV型 β 内酰胺酶耐药基因序列 ,并确定其所产ESBLs亚型。 方法 从住院病人的送检标本中分离的 6 0株鲍曼不动杆菌中 ,经药敏试验、ESBLs表型确证试验和SHV型 β内酰胺酶耐药基因的聚合酶链反应 (PCR)检测 ,筛选出 1株具有多重耐药特性、ESBLs表型和SHV基因型均阳性的分离株 (HZ0 2株 ) ,对其耐药基因进行序列分析。 结果 HZ0 2株基因片段长 82 5个核苷酸 ,与Nuesch -Inderbinen等从肠杆菌中发现的SHV 12型ESBLs编码基因序列 (GenBank注册号 :X9810 5 )完全相同。 结论 HZ0 2株鲍曼不动杆菌可产生SHV 12型ESBLs,从而证实了我国临床分离的鲍曼不动杆菌中存在产SHV 12亚型ESBLs菌株。其序列已在美国核酸数据库 (GenBank)登录 (注册号 :AY2 5 916 3)。

SHV型超广谱β-内酰胺酶的研究进展

β-内酰胺酶的产生是细菌对β-内酰胺抗生素耐药的主要机制。SHV型超广谱β-内酰胺酶在革兰阴性耐药菌中普遍存在,并通过不断的点突变,拓宽了酶活性谱或增强了耐受β-内酰胺酶抑制剂的能力。现就SHV型超广谱β-内酰胺酶研究进展作一综述。

SHV型超广谱β-内酰胺酶的表达及其抗药活性

目的:原核表达SHV型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)并分析其抗药活性。方法:收集2006年至2007年郑州大学第一附属医院分离ESBLs大肠埃希菌46株,采用PCR克隆目的基因,采用基因重组技术构建pET28a-SHV质粒,采用JM109大肠埃希菌作为宿主菌进行ESBLs的表达,采用液体稀释法检测其最小抑菌质量浓度(MIC)。结果:pET28a-SHV质粒PCR扩增条带在约900bp位置处,其序列分析结果正确;头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径差>5mm;pET28a-SHV质粒转化子对头孢唑啉、庆大霉素及阿米卡星耐药(MIC均>6mg/L),对氨曲南、左氧氟沙星中介耐药(MIC分别为16及8mg/L),对广谱青霉素和三代头孢菌素体外敏感,对药物酶抑制剂及亚胺培南稳定敏感。结论:SHV型ESBLs表达成功,转化子对抗菌药物体外敏感率较高。

大庆地区革兰阴性杆菌SHV型ESBLs基因型调查

目的了解大庆地区革兰阴性杆菌中SHV型ESBLs基因型的分布状况。方法采用双纸片协同法(DDS)、PCR法,检测ESBL阳性革兰阴性杆菌中的SHV基因。结果254株临床分离的多重耐药革兰阴性杆菌中共检出26株携带SHV基因,分别为SHV-28、SHV-12、SHV-5、SHV-1以及SHV-11五种基因型。携带blaSHV基因的细菌主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。结论在大庆地区首次检出SHV-28,SHV-12,SHV-5型ESBLs基因,首次检出SHV-1,SHV-11型β-内酰胺酶基因;大庆地区革兰阴性杆菌携带多种类型SHV型ESBLs基因。

焦磷酸测序检测铜绿假单胞菌的SHV基因点突变

目的:通过焦磷酸测序技术检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)铜绿假单胞菌的SHV基因点突变,探讨一种快速、准确的ESBLs基因分型方法。方法:双纸片法确定产ESBLs的铜绿假单胞菌,纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验,聚合酶链反应(PCR)法扩增ESBLs的SHV基因片段,用焦磷酸测序法检测16株产ESBLs铜绿假单胞菌的SHV基因35位和43位密码子点突变。结果:焦磷酸测序发现,本地区分离出的16株产ESBLs铜绿假单胞菌有10株扩增出SHV基因片段,且在43位密码子基因没有突变,35位密码子有基因突变,核苷酸由T突变为A,亮氨酸变为谷氨酰胺,突变发生率达到70%(7/10)。16株产ESBLs的菌株对亚胺培南全部敏感。结论:焦磷酸测序技术可快速检测产ESBLs铜绿假单胞菌的SHV基因点突变,具有准确、快速、实时和高通量等优点,可应用于产ESBLs菌株的ESBLs基因分型。

β-内酰胺酶TEM和SHV族

TEM和SHV族β-内酰胶酶(包括广谱β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶和耐酶抑制剂β-内酰胺酶)是肠杆菌科细菌耐药的主要机制,不同氨基酸位点突变引起不同耐药性的改变。本文对其作用机制、分子结构及演变过程作了综述,以指导抗生素在临床上的合理应用。

来自肺炎克雷伯菌的SHV型β-内酰胺酶基因的克隆、表达与纯化

为研究先前筛得的可抑制TEM-1型β-内酰胺酶的多肽SIPIS-04-01对SHV型β-内酰胺酶的结合能力,从一株临床耐β-内酰胺类抗生素的肺炎克雷伯菌10032克隆了SHV型β-内酰胺酶基因,并替换质粒pUC18上原有的bla基因,转化大肠杆菌DH5α后表明该基因使宿主菌具有抗氨苄青霉素的能力。进一步将其克隆到一个高效表达载体pLY-5中,优化表达和纯化条件获得了SHV型β-内酰胺酶。体外试验证明该酶能降解氨苄青霉素,重组多肽SIPIS-04-01对此降解有所抑制。

吉戈菲肠杆菌中SHV-2耐药基因的序列分析

近来一个值得注意的现象,即肠杆菌科中某些菌属对头孢噻甲羧肟(ceftazidime,caz)等三代头孢菌素的耐药有不同程度增长,这是由于细菌产生了超广谱β-内酰胺酶(ESbla),或染色体Ⅰ型酶所致.在我们前一步的研究中,发现一耐caz的Ent.gergoviae菌株,含有一约60kb的可接合转移质粒pC3773.其上有一编码SHV类ESbla的基因,为深入了解此ESbla基因的分子特点,以及酶结构与功能的关系,本文用测定核苷酸序列的方法进行了研究.