HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。

小鼠Islet-1基因慢病毒表达载体的构建及其诱导C_3H_(10)T1/2细胞向心肌样细胞特异性分化

目的研究Islet-1对干细胞分化的影响。方法用PCR钓取目的基因,将目的基因与pLenO-WPI载体连接,选取阳性质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞生产出慢病毒载体。感染C3H10T1/2细胞,实时荧光定量PCR及Western blot检测Islet-1和心肌、肝脏、骨骼及神经各系统相关标志物的表达,免疫荧光检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达部位。结果 PCR及测序显示目的片段正确插入,实验组有Islet-1表达;心肌早期发育相关基因GATA-4、MEF2C、NKx2.5在检测到荧光蛋白1周后升高,2周到达高峰,3周后可检测到心肌特异性蛋白cTnT(0.582±0.0576),其时序性表达呈随时间增强趋势;cTnT表达于胞质;肝脏系统特异性标志AFP及ALB、骨骼系统特异性标志BGP及BALP、神经系统特异性标志Nestin及GFAP均未表达。结论 Islet-1具有特异性促进干细胞向心肌样细胞分化的作用。

髓系触发受体-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建髓系触发受体-1(TREM-1)基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用。方法:根据小鼠TREM-1 mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNAoligo,其两端含酶切位点黏端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,经PCR及测序鉴定后,将以上质粒分别与包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用real-time PCR和ELISA检测TREM-1 mR-NA和蛋白表达水平。实时定量PCR和ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后均可以显著抑制TREM-1的表达,以pGCSIL-GFP/Lenti-1组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体,所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌内毒素所诱导的TREM-1的表达。

大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体的构建与包装

目的构建大鼠少突胶质细胞转录因子1(Olig1)的慢病毒表达载体,并进行鉴定和包装。方法采用聚合酶链反应(PCR),分别以大鼠pEGFP-N3-Olig1表达质粒和pDsRed-monomer-N1为模板,扩增获得大鼠Olig1片段和红色荧光蛋白(RFP)片段。将两者进行PCR拼接获得Olig1-RFP片段,并与pLenti6.3-MCS-DEST载体连接,构建获得pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体,并进行酶切鉴定、测序。然后,将其与包装质粒混合后共转染HEK293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒。结果通过酶切鉴定、测序,证明pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达载体构建成功,且能够被高效地包装为病毒颗粒。结论成功建立大鼠pLenti6.3-Olig1-RFP慢病毒表达系统,为进一步研究Olig1的生物学作用提供了实验基础。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

肾癌786-O细胞B4GALNT1基因RNA干扰模型构建与鉴定

目的构建靶向抑制β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(B4GALNT1)基因表达的shRNA慢病毒载体,稳定转染至人肾癌细胞株786-O中,观察转染后抑制效率及对786-O细胞增殖活性的影响。方法构建特异性靶向抑制B4GALNT1基因表达的shRNA慢病毒载体(shB4GALNT1),通过琼脂糖凝胶电泳和阳性克隆测序鉴定载体的构建;慢病毒包装并稳定转染至肾癌786-O细胞中,通过荧光显微镜观察shRNA转染细胞;实验分为3组:空白对照(NC)组、转染空载体(VC)组和转染shB4GALNT1(KD)组,分别通过Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应来证实转染shB4GALNT1在蛋白与mRNA表达水平的抑制效率;通过Celigo全视野细胞扫描分析抑制B4GALNT1表达对786-O细胞增殖活性的影响。结果琼脂糖凝胶电泳证实阳性克隆为341 bp,阳性克隆测序证实B4GALNT1 shRNA慢病毒表达载体构建成功;绿色荧光蛋白表达证实B4GALNT1 shRNA慢病毒表达载体转染至肾癌786-O细胞中;NC组、VC组和KD组B4GALNT1蛋白的相对表达量分别为1.013±0.057、0.916±0.055、0.340±0.030,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),B4GALNT1蛋白表达抑制率达63%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);NC组、VC组和KD组B4GALNT1 mRNA的相对表达量分别为1.021±0.078、1.002±0.074、0.078±0.027,KD组与VC组比较差异有统计学意义(P<0.01),表达抑制率达92%,NC组与VC组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后第2~5天,抑制B4GALNT1表达可显著降低786-O细胞增殖活性(P<0.01)。结论本实验成功构建RNA干扰靶向抑制B4GALNT1基因的慢病毒表达载体,并稳定转染人肾癌786-O细胞,抑制B4GALNT1表达可显著降低细胞增殖活性。

含B7-H1 shRNA基因的慢病毒表达载体的制备及其抑制效果鉴定

目的设计针对B7-H1的shRNA序列,构建慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后检测其对U251细胞中B7-H1基因的沉默效果。方法设计3对针对B7-H1 mRNA的shRNA,化学合成正义链和反义链,退火后与酶切后的pLKO.1载体进行连接。测序正确后包装成病毒并感染U251细胞,分别用qRT-PCR及Western blot法检测干扰效果。结果 qRT-PCR及Westernblot结果证实设计的3条RNA干扰序列中有2条可有效沉默U251细胞中B7-H1的表达。结论所制备的针对B7-H1的shR-NA慢病毒能特异性沉默B7-H1。

稳定过表达幼虫巨大致死基因2(LLGL2)的食管鳞癌细胞系的建立

目的构建人幼虫巨大致死基因2(LLGL2)慢病毒表达载体,并建立稳定表达的人食管鳞癌KYSE450细胞系和TE-1细胞系。方法 PCR扩增人LLGL2全长基因序列,连接插入至pCDH-CMV-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒载体中,并对重组质粒进行双酶切及测序验证。将重组质粒pCDH-CMV-LLGL2-IRES-GFP-EF1-Puro和PHR、水疱性口炎病毒G蛋白(VSVG)共转染HEK293T细胞进行病毒包装,利用该病毒液感染KYSE450细胞和TE-1细胞。经嘌呤霉素筛选建立LLGL2稳定过表达的KYSE450细胞系和TE-1细胞系,用Western blot法检测LLGL2的表达情况。结果双酶切和测序分析,成功构建pCDH-CMVLLGL2-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒表达载体质粒。Western blot法检测结果显示,与对照组相比,感染病毒液的细胞LLGL2蛋白水平明显增高。结论成功建立了稳定过表达LLGL2基因的KYSE450细胞系和TE-1细胞系。

髓系细胞触发受体1慢病毒载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达的影响

目的了解髓系细胞触发受体1（TREM-1）基因重组慢病毒短发夹RNA（vshRNA）载体对脆弱拟杆菌脓毒症小鼠促炎因子表达及小鼠存活率的影响。方法（1）构建TREM-1 vshRNA载体。经实验确定脓毒症小鼠模型制作条件：腹腔注射2．5×10^9CFU／mL灭活脆弱拟杆菌0．5mL，刺激12h。（2）115只小鼠按随机数字表法分为健康对照组（3只）和脓毒症模型组、绿色荧光蛋白（GFP）干扰组、TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组。后4组每组28只，先分别经尾静脉注射等渗盐水、GFPvshRNA、TREM-1 vshRNA 2×10^8TU、TREM-1 vshRNA 1×10^8TU；1h后，将该4组小鼠制成脓毒症模型，健康对照组注射等体积等渗盐水。12h后处死5组小鼠（每组3只），取血检测血浆TNF-α、IL-1β和IL-6含量；取肝组织标本检测TREM-1 mRNA及其蛋白的表达水平。后4组小鼠每组所余25只用于观察腹腔注射后72h的存活率。（3）另建立脓毒症小鼠模型125只，其中100只分别于腹腔注射后1、2、4、6h尾静脉注射TREM-1 vshRNA 2×10^8Tu（每时相点25只），余下25只尾静脉注射等渗盐水为对照组。计算尾静脉注射后72h小鼠存活率。结果（1）与脓毒症模型组比较，TREM-1干扰组、TREM-1半量干扰组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-6含量均下降（P〈0．05），以TREM-1干扰组下降最明显。GFP干扰组中各促炎因子含量与脓毒症模型组接近（P〉0．05）。（2）与GFP干扰组比较，TREM-1干扰组及其半量干扰组小鼠肝组织TREM-1 mRNA表达均明显下调（P〈0．01），以TREM-1干扰组尤为明显（P〈0．05）。各组小鼠TREM-1蛋白表达情况与此一致。（3）脓毒症模型组、GFP干扰组小鼠腹腔注射后72h存活率均为16％。TREM-1干扰组及其半量干扰组分别为76％和44％（P〈0．05或P〈0．01）。（4）另建立的125只脓毒症小鼠模型中，对照组及腹腔注射后1、2、4、6h组其尾静脉注射后72h存活率分别为16％、72％、56％、40％、16％，其中1、2、4h组明显高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）。结论运用TREM-1 vshRNA干扰技术，可有效降低脆弱拟杆菌脓毒症小鼠肝组织TREM-1表达水平，抑制炎性反应，提高小鼠存活率。

髓系触发受体-1在脆弱类杆菌诱导小鼠脓毒血症中的作用

目的探讨小鼠TREM-1基因重组慢病毒干扰载体(Lentivector,LV)TREM-1 vshRNA对脆弱杆菌脓毒血症小鼠脾脏中促炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6表达及NF-κB通路的影响。方法将清洁级BALB/c雄性小鼠分成4组,即正常对照组(C组),脆弱类杆菌脓毒症模型生理盐水组(S组),TREM-1 vshRNA干扰实验组(T组)和GFPvshRNA干扰实验组(G组)。观察各组中小鼠脾内TREM-1,TNF-α,IL-1β,lL-6的蛋白表达以及IkBa,pDAP12,NF-κB p65的表达情况的变化。结果与C组比,T组TREM-1 mRNA及蛋白表达均有显著增加(P<0.01);T,G,S组脾细胞中TNF-α,IL-1β,IL-6的含量均较C组显著增加(P<0.01);T组脾细胞中TNF-α,IL-1β,IL-6的含量均较S,G组明显降低(P<0.01)。S组脾细胞中的pDAP12和核内NF-κB p65蛋白表达水平明显增强,IκBa蛋白表达水平降低;而T组与S组比较,pDAP12和NF-κB p65蛋白的表达水平显著下调。结论小鼠TREM-1基因重组慢病毒干扰载体可选择性抑制TREM-1表达,下调脆弱类杆菌诱导的促炎症因子的分泌,而转染可能是通过下调DAP12的表达,稳定IkBa/NF-κB复合物,抑制TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8基因的转录,而对脆弱类杆菌脂多糖炎症反应产生抑制作用。

慢病毒介导的异柠檬酸脱氢酶1基因R132H突变过表达抑制脑胶质瘤LN229细胞的成球能力

目的研究慢病毒介导的异柠檬酸脱氢酶1（IDHl）R132H突变体过表达对脑胶质瘤LN229细胞成球能力的影响。方法构建IDH1 R132H突变型慢病毒载体介导的LN229、U87和}14脑胶质瘤细胞株，经嘌呤霉素抗性筛选，获得稳定表达IDH1 R132H的细胞株，以IDH1野生型（WT）的胶质瘤细胞株为对照。利用荧光显微镜和Western blot的方法检测稳定转染IDH1 R132H细胞株的表达情况。使用无血清培养基培养LN229细胞，并加入B27添加剂、表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）后，观察IDH1 R132H突变对LN229细胞成球能力的影响。结果经测序分析，成功构建了IDH1 R132H突变型慢病毒表达载体。慢病毒包装后体外感染脑胶质瘤细胞株LN229、U87和H4，荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白的表达；Western blot检测结果显示，与转染IDH1 WT对照组相比，转染IDH1 R132H突变型载体的3种细胞株IDH1 R132H均表达阳性；转染IDH1 R132H慢病毒载体的LN229细胞的成球能力较转染IDH1 WT的对照组明显减弱（P〈0．05）。结论慢病毒介导的IDH1基因R132H突变过表达抑制脑胶质瘤LN229细胞的成球能力，IDH1基因R132H突变可能在脑胶质瘤干性中起关键作用。

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。