肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建

目的运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^(Δhep))小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法将loxP标记的Sirt3 ^(flox/flox)小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^(+/+))小鼠进行交配,F1代Sirt3^(flox/-)/Alb-Cre^(+/-)小鼠再与Sirt3^(flox/flox)小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(+/-)的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^(Δhep)小鼠,Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(-/-)小鼠即为对照小鼠Sirt3 ^(flox/flox)小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观察Sirt3在小鼠肝细胞中的表达;提取Sirt3^(Δhep)小鼠原代肝细胞及心脏、脾脏、肾脏、肺组织蛋白,Western blot法验证Sirt3在小鼠肝细胞及其他组织中的表达水平;HE染色观察小鼠肝脏及心脏、脾脏、肺等组织结构。结果成功鉴定出Sirt3^(Δhep)小鼠;免疫荧光及Western blot结果显示,小鼠肝细胞中Sirt3蛋白表达水平低于对照组小鼠(P<0.01),而Sirt3^(Δhep)小鼠的心脏、脾脏、肾脏和肺组织中Sirt3表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);HE染色结果显示Sirt3^(Δhep)小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏的组织学特征与对照组小鼠相比无明显变化。结论成功构建肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠,为进一步研究肝细胞Sirt3基因在相关疾病中的调控作用机制奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。

Sirt3过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Sirt3全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Sirt3全长基因并克隆入pc DNA3.1载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1000 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的pc DNA3.1-Sirt3质粒转入AGS和SGC-7901细胞,检测到Sirt3的m RNA和蛋白表达水平均提高。结论:构建获得Sirt3基因高效真核表达载体,将用于Sirt3的功能研究。

非酒精性脂肪性肝病风险基因SIRT3的关联验证和体内过表达效应研究

目的研究肝脏脂肪酸氧化关键分子SIRT3编码基因变异与非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)发生的关系,并在小鼠体内研究人源SIRT3保护性等位型基因过表达对脂肪肝相关表型的影响。方法建立非酒精性脂肪肝的人群研究队列,提取基因组DNA对编码区基因变异rs11246020进行基因分型,并与疾病发病与否做关联分析;建立小鼠NAFLD模型,在小鼠肝脏过表达人源SIRT3基因,8周后检测小鼠肝脏相关生化指标及肝脏HE染色、油红O染色情况,并提取RNA和蛋白采用Real-time PCR和Western blot检测Pparα、Acox1、cpt1a、cpt1b和SIRT3的转录或表达水平。结果与对照组相比,SIRT3基因编码区错意突变rs11246020的GA+AA基因型在NAFLD组分布较低,而GG基因型分布较高,差异具有统计学意义(P<0.05);在小鼠肝脏过表达人源SIRT3的A等位型基因后,肝脏脂肪蓄积降低,肝细胞空泡化程度降低,肝脏和血清游离脂肪酸以及肝脏甘油三酯、总胆固醇水平显著降低(P<0.05),肝脏脂肪酸代谢相关基因Pparα和Acox1基因转录水平降低(P<0.05)。同时,小鼠体质量上升被有效控制(P<0.05)。结论 SIRT3基因变异rs11246020与NAFLD风险相关,小鼠体内过表达SIRT3可显著改善脂肪酸代谢和肝脏脂肪蓄积。

Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的表达

目的构建Sirt3基因过表达慢病毒载体,通过稳定感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立Sirt3基因过表达的SH-SY5Y细胞株,为研究Sirt3在帕金森病细胞模型中的作用提供新的方法。方法从GenBank中检索Sirt3基因序列,根据此序列设计并合成人Sirt3基因引物,扩增Sirt3基因的cDNA片段,将其克隆至慢病毒载体Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin中,构建慢病毒表达质粒。采用聚合酶链反应方法对阳性克隆进行鉴定和测序分析。将重组过表达病毒质粒及其2种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,测定病毒滴度。取对数生长期SH-SY5Y细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和Sirt3组,空白对照组SH-SY5Y细胞仅加入普通培养基,阴性对照组SH-SY5Y细胞转染阴性对照病毒,Sirt3组SH-SY5Y细胞转染Sirt3过表达慢病毒。转染后加入嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞。使用实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blot检测各组细胞中Sirt3mRNA和蛋白相对表达量。结果成功扩增Sirt3基因片段,大小1242bp;测序分析结果显示,过表达慢病毒Sirt3与GenBank中Sirt3基因序列完全一致,病毒滴度为1.2×10^12TU·L^-1。Sirt3组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);空白对照组与阴性对照组细胞中Sirt3 mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论Sirt3基因过表达慢病毒载体可成功构建,并获得稳定表达Sirt3基因的SH-SY5Y细胞株。

小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具。利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的c DNA片段,将其克隆至慢病毒载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP中,构建慢病毒表达质粒。进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度。用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON)。收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达。Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0×10~9TU/m L。Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P<0.01)。成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具。

SIRT3基因多态性与年龄相关性疾病的研究进展

Sirtuins家族是一类高度保守的NAD+依赖性Ⅲ组蛋白去乙酰化酶,通过催化一系列脱乙酰和ADP核糖基化的非组蛋白而构成了正常与病理条件下代谢完整性、细胞存活和细胞同源性的表观遗传调控的一个重要方面。作为Sirtuins家族具有最强去乙酰化酶活性的一员,SIRT3 (Sirtuin 3)凭借其广泛的调控线粒体形态与功能的能力,成为近几年来的研究热点。最近的一些研究发现,SIRT3过表达可以在体内及体外模型中预防某些神经紊乱,如衰老、帕金森病、阿尔茨海默病、卒中等年龄相关性疾病。目前人们较少关注SIRT3基因多态性在年龄相关疾病中的作用。因此,本文将系统性地对SIRT3基因的结构定位、细胞代谢及其在年龄相关性疾病中的作用作一总结。

陕西小菜蛾对9种杀虫剂的抗药性监测

【目的】明确陕西关中地区小菜蛾田间种群对9种常用杀虫剂的抗药性现状，为抗性治理和田间有效防治小菜蛾提供依据。【方法】在室内采用生物测定法和区分剂量法，测定2012-2013年间陕西杨凌、宝鸡和渭南3个地区小菜蛾田间种群对阿维菌素、高效氯氰菊酯、丁醚脲、啶虫隆、溴虫腈、茚虫威、多杀菌素、Bt毒素Cry1Ac和氯虫苯甲酰胺9种常用杀虫剂的敏感性。【结果】陕西3个地区的小菜蛾田间种群对大部分供试药剂都产生了不同程度的抗性。宝鸡、渭南和杨凌种群均对高效氯氰菊酯产生了高极高水平抗性，对阿维菌素产生了中等高水平抗性，对溴虫腈和啶虫隆产生了低中等水平抗性，对茚虫威、多杀菌素和氯虫苯甲酰胺的抗性水平相对较低，处于敏感低水平抗性。对丁醚脲和Bt毒素的抗性各地差异较大，对丁醚脲的抗性，杨凌种群处于低中等水平抗性，渭南种群处于中等水平抗性，宝鸡种群处于敏感性下降；对Bt毒素的抗性，宝鸡种群处于中等水平抗性，杨凌和渭南种群处于敏感性下降低水平抗性。【结论】3个地区应停止使用已产生高水平抗性的高效氯氰菊酯和阿维菌素，减少已产生中等水平抗性药剂的使用次数，处于低水平抗性的杀虫剂可作为防治小菜蛾的主要药剂。在杀虫剂使用过程中应注意药剂的轮换使用，以延缓小菜蛾抗药性加剧。

SIRT3基因多态性与猪肉质性状的关联分析

为了探索SIRT3基因多态性与猪肉质性状的关联性,通过引物设计、PeR扩增、测序以及酶切分型,对SIRT3基因的突变位点进行检测和分析,确定了SIRT3基因的三种基因型,并将SIRT3基因的三种基因型与湘村黑猪、大围子猪的肉质性状进行了关联分析。结果表明:在猪SIRT3基因的第五外显子上存在一处A/G突变位点,形成AA、AG和GG三种基因型。进行猪SIRT3基因多态性分析可知,GG基因型频率和等位基因频率在两猪种中占有绝对优势,且在湘村黑猪中并未检测出AA基因型突变个体;进行猪SIRT3基因突变位点遗传多样性分析可知,湘村黑猪的多态信息含量(PIC)小于0.25,为低度多态,大围子猪的PIC含量在0.25~0.50之间,为中度多态。进行基因多态性与猪肉质性状的关联分析,在大围子猪24小时滴水损失、失水率和肌内脂肪含量三个性状中,AA基因型与AG、GG基因型相比差异显著(P<0.05);而湘村黑猪仅有肌肉色值中的亮度值(L^*值)在各基因型之间存在显著性差异(P<0.05),其余性状之间并不存在差异显著性(P>0.05)。由此得出,SIRT3基因突变基因型可以提高猪肉品质,SIRT3基因可作为影响猪肉质性状的候选基因进行深入研究分析。

肾透明细胞癌组织40例En-1相关基因表达意义

目的检测同源异型盒基因家族中En-1及其相关基因FoxO1和Sirt3在肾透明细胞癌(ccRCC)不同病理分级中的表达情况,为ccRCC的治疗提供新的思路。方法收集2017-07-01-2018-10-31宁夏医科大学总医院术后病理诊断为ccRCC组织及癌旁组织(距癌组织>2 cm)40例,根据病理Fuhrman分级分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级共3组。采用免疫组织化学和蛋白质印迹法检测En-1、FoxO1、Sirt3和p-FoxO1在癌组织及癌旁正常组织的表达及定位情况,以方差分析进行组间比较。结果免疫组化结果显示,癌组织中En-1、FoxO1、Sirt3和p-FoxO1阳性表达较癌旁组织中少,且随着病理分级的增加,阳性表达逐渐减少。蛋白质印迹法结果显示,En-1(H=14.749,P=0.001)、Sirt3(H=15.158,P=0.001)、FoxO1(F=177.710,P<0.001)和p-FoxO1(F=134.869,P<0.001)在癌组织中的表达低于癌旁正常肾组织;两两多重组间比较发现,不同Fuhrman分级与癌旁正常肾组织相比,En-1(P_(Ⅰ级-癌旁)=0.785,P_(Ⅱ级-癌旁)=0.022,P_(Ⅲ级-癌旁)<0.001)、Sirt3(P_(Ⅰ级-癌旁)=0.850,P_(Ⅱ级-癌旁)=0.017,P_(Ⅲ级-癌旁)<0.001)、FoxO1(P_(Ⅰ级-癌旁)=0.001,P_(Ⅱ级-癌旁)<0.001,P_(Ⅲ级-癌旁)<0.001)和p-FoxO1(P_(Ⅰ级-癌旁)<0.001,P_(Ⅱ级-癌旁)<0.001,P_(Ⅲ级-癌旁)<0.001)表达降低。结论En-1及其相关Sirt3、FoxO1和p-FoxO1基因在癌旁肾组织中呈高表达,在癌组织中呈低表达,且随着病理分级的增加表达逐渐降低。这表明其可能与ccRCC的发生有关,对En-1及其相关基因的检测可能成为ccRCC临床诊断新的标志物或新的治疗靶点。