姜黄素对人肝癌细胞Sk-hep-1抗癌作用的研究

目的:研究姜黄素对人肝癌细胞Sk-hep-1体外抗癌作用,探讨其抗癌作用的分子机制。方法:应用MTT法、DA-PI核染色法和细胞周期分析法,检测姜黄素对Sk-hep-1细胞生长和凋亡的影响,并通过RT-PCR方法检测姜黄素对Sk-hep-1细胞抗凋亡基因(Survivin和Bcl-xL)和耐药基因(DRG2和MDR1)mRNA表达的影响。结果:姜黄素抑制Sk-hep-1细胞增殖呈量效关系。姜黄素处理组肝癌细胞Sk-hep-1,HepG2和Hep3B细胞发生不同程度的凋亡,正常肝细胞Chang’s liver无明显凋亡。姜黄素处理组Sk-hep-1细胞周期发生变化,G0/G1或G2/M期细胞比例增多。姜黄素处理组Sk-hep-1细胞耐药基因MDR1 mRNA水平显著下降,而抗凋亡基因的表达无明显变化。结论:姜黄素能够抑制Sk-hep-1细胞增殖,并诱导其凋亡,推测可能是通过下调MDR1 mRNA的表达而起作用。

槐耳蛋白聚糖TPG-1抑制人肝癌SK-HEP-1细胞生长的机制

目的:蛋白聚糖TPG-1具有良好的抗肝癌活性,本研究进一步探究蛋白聚糖TPG-1抗肝癌的分子作用机制。方法:用槐耳蛋白聚糖TPG-1(0,0.05,0.1,0.25,0.5,1 g·L^(-1))处理人肝癌SK-HEP-1细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测槐耳蛋白聚糖TPG-1对SK-HEP-1细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测TPG-1对SK-HEP-1细胞凋亡的影响。对经TPG-1处理过的人肝癌SK-HEP-1细胞进行基因芯片检测分析,探讨TPG-1抗肝癌的分子作用机制。结果:与空白组比较,槐耳蛋白聚糖TPG-1能够显著抑制人肝癌SK-HEP-1细胞的增殖能力(P<0.01)。TPG-1(1 g·L^(-1))作用于SK-HEP-1细胞48 h,SK-HEP-1细胞凋亡率显著增加(P<0.01),且TPG-1给药能够显著促进细胞凋亡重要执行者含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3和Caspase-7的剪切水平(P<0.01)。与空白组比较,TPG-1(0.1 g·L^(-1))能够抑制SK-HEP-1细胞的迁移能力(P<0.05)。基因芯片检测分析结果显示,TPG-1处理后,SK-HEP-1细胞中差异表达基因有971个,其中表达上调基因486个,表达下调基因485个。基因本体(GO)和通路(Pathway)分析结果显示表达差异基因的功能主要涉及白细胞介素-6(IL-6)生物合成、抗原加工与呈递、超氧化物歧化酶活性、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)级联反应的正调控、自然杀伤(NK)细胞趋化、趋化因子生物合成等。此外,表达差异基因所涉及的信号通路主要包括核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体信号通路,凋亡,Toll样受体信号通路,维甲酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体信号通路,T细胞受体信号通路及趋化因子信号通路等。蛋白免疫印迹法结果显示,TPG-1(1 g·L^(-1))能够显著激活SK-HEP-1细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(P<0.01)。结论:槐耳蛋白聚糖TPG-1能够抑制人肝癌SK-HEP-1细胞增殖及迁移能力并促进其发生凋亡,MAPK信号通路的激活可能与TPG-1发挥抑制人肝癌SK-HEP-1细胞生长作用有关。

GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及其对生长因子促细胞增殖效应的影响

目的:通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)对成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2,FGF2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-2,IGF2)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)促细胞增殖效应的影响。方法:应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-N2-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,经脂质体LipofectamineTM2000介导转染SK-Hep-1后,通过G418(600μg/ml)筛选出抗性克隆,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GPC3mRNA在真核细胞中的表达,Western印迹法检测GPC3蛋白在真核细胞中的表达,并在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况,采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2、TGF-β1、BMP4促细胞增殖效应的影响。结果:限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR及Western印迹法表明GPC3在真核细胞中成功表达,GPC3抑制了FGF2对SK-Hep-1细胞的增殖效应,而不抑制IGF2、TGF-β1、BMP4的促增殖作用。结论:编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用。

GPC3抑制肝癌细胞增殖的机制与生长因子IGF2、BMP4之间的关系

目的:应用构建完成的GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究GPC3对SK-Hep-1肝癌细胞增殖的影响及生长因子IGF2、BMP4与GPC3抑制肝癌细胞增殖之间的关系。方法:pEGFP-N2-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体经脂质体LipofectamineTM2000介导转染SK-Hep-1肝癌细胞后,通过G418(600ug/ml)筛选出抗性克隆,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GPC3mRNA在真核细胞中的表达,Western-blot检测GPC3蛋白在真核细胞中的表达,确定GPC3已经成功转入细胞后,采用MTT法研究GPC3对SK-Hep-1肝癌细胞增殖的影响及生长因子IGF2、BMP4与GPC3抑制肝癌细胞增殖之间的关系。结果:荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR及Western-blot表明GPC3在真核细胞中成功表达,基因转染组与空白对照组、空质粒转染组相比增殖明显减慢,有显著性意义(P<0.001),GPC3对生长因子IGF2、BMP4促肝癌细胞增殖无影响(P>0.05)。结论:成功筛选稳定表达GPC3蛋白的SK-Hep-1肝癌细胞系;GPC3抑制肝癌细胞增殖;GPC3与生长因子IGF2、BMP4信号通路可能无联系。

重组质粒pEGFP-N2-GPC3的构建及GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进细胞增殖的影响

目的:构建GPC3基因真核表达重组质粒,研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响。方法:自行设计引物,应用PCR法从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB-GPC3中获得编码GPC3的基因片段。应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过G418(600ug/ml)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及RT-PCR法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响。结果:限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组相比有显著性意义(P<0.05),IGF2实验组与空质粒转染组相比无显著性意义(P>0.05)。结论:测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用。