托佩克猪SLA-2与β2m复合体的构建

以托佩克猪重链基因SLA-2和轻链基因β2m为研究对象,体外通过剪接重叠延伸PCR(spli-cing overlap extension PCR,SOE-PCR)技术重构复合体,并将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体菌TB1并进行表达。结果显示,体外重构的托佩克猪SLA-2与β2m复合体基因以融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m的形式表达,大小为84.1ku。为进一步在体外进行该品系猪复合体与多肽结合研究奠定了基础。

托佩克猪SLA-2基因克隆及功能区生物信息学分析

为研究托佩克猪SLA-2基因功能,设计引物,克隆了该品系猪SLA-2基因(SLA-2-TPK)cDNA全长序列,并通过分子生物学软件分析其基因特征。结果显示,SLA-2-TPK cDNA全长为1 119 bp,其中3-1 097为编码区,共编码364个氨基酸,分别在第125、188、227和283位置出现半胱氨酸残基,含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示,SLA-2-TPK与其他SLA-2、SLA-3和SLA-1序列的同源率分别为86.0%-98.9%、85.0%-89.4%和84.2%-91.7%。系统进化树显示,SLA-2-TPK与韩国品系猪DQ883211遗传距离较近;各功能区分析,SLA-2-TPK与人HLA-A2和小鼠H-2K分子结构相似,且保留了人HLA-A2基因的部分功能位点。结果表明,SLA-2-TPK是典型的SLA-2等位基因,在进化程度上接近于部分韩国品系猪。

巴马小型猪SLA-2和β_2m复合体蛋白的构建及二级结构测定分析

以巴马小型猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m基因。然后采用剪接重叠延伸PCR(Splicing overlap exten-tion PCR,SOE PCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m。将SLA-2-Linker-β2m在pMAL-p2X系统上表达,其融合表达蛋白分别经过West-ern-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)测定蛋白的二级结构。结果显示,重构表达的复合体融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m大小为84.1 ku。切割后去除MBP的单体蛋白大小为41.6 ku。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、97.3%、97.1%和97.9%,揭示重构的复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。

广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性研究

为探讨广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的多态性,以其耳组织为试验材料,经PCR扩增获得广西巴马小型猪SLA-DQB外显子2片段,片段大小为273 bp,含有1个RsaI酶切位点和5个HaeIII酶切位点,基因型分别为27bp/246 bp和84 bp/83 bp/7 bp/16 bp/29 bp/54 bp。采用PCR-RFLP对30头广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2的PCR扩增产物进行多态性分析,发现广西巴马小型猪封闭群内S,LA-DQB基因外显子2无多态性位点;而克隆测序及同源性比较分析表明,广西巴马小型猪SLA-DQB基因外显子2序列与普通猪(Sus Scrofa)、人类(Homo sapiens)的同源性分别为94.1%、79.1%。

合作猪SLA-DQA基因外显子2多态性分析

旨在研究合作猪DQA基因外显子2多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各个等位基因之间的遗传关系,分析其进化意义。选用PCR-SSCP对439只合作猪SLA-DQA基因外显子2的多态性进行检测;测序群体内因变异而产生的各等位基因序列,并分析序列数据。结果显示,在合作猪SLA-DQA外显子2中发现了7个新等位基因,共18个核苷酸多态位点,10个氨基酸多态位点。合作猪SLA-DQA外显子2具有较丰富的多态性,群体内可能蕴藏着更加丰富的遗传资源;合作猪SLA-DQA外显子2基因最初可能由一个等位基因突变分化成一大类基因;合作猪SLA-DQA外显子2序列与各个猪种的SLA-DQA外显子2序列具有较高的同源性,预示着这些猪种的SLA-DQA外显子2基因最早可能来源于其分歧之前的共同祖先原始序列;新发现的7个SLA-DQA外显子2等位基因,可能由遗传关系较近的两个等位基因突变产生。

托佩克猪SLA-2基因克隆与表达

为提高托佩克猪SLA-2-TPK基因胞外区在pET-21a的表达量,对其5′端进行密码子优化,并设计表达引物,PCR扩增SLA-2-TPK胞外区,然后克隆入pMD○R19-T Simple Vector,经酶切鉴定后连接至pET-21a载体,转化BL21(Rosseta)进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。PCR结果显示,SLA-2-TPKe大小约为850bp,并成功克隆入pMD○R19-T Simple Vector,双酶切后大小为834bp。酶切后的SLA-2-TPKe成功与pET-21a链接,重组菌经诱导后目的蛋白大小为30.9ku,与密码子优化前重组菌相比,目的蛋白相对表达含量提高约40%。研究证明,密码子优化可明显提高蛋白的表达量,为进行其他蛋白表达研究提供了参考。

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。

烟台黑猪SLA-2基因真核表达载体的构建及表达

为构建烟台黑猪SLA-2基因(SLA-2-YT)的真核表达载体SLA-2-YT/pCDH并将其在真核细胞中表达,根据SLA-2-YT编码区基因序列设计1对引物,以SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体为模板进行PCR扩增获得SLA-2-YT编码区基因片段,在上下游引物的5'端分别添加限制性内切酶Xba I和Not I的酶切位点,将目的基因经pMD 19-T Simple Vector TA克隆后与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表达载体连接,获得的重组质粒转化至大肠杆菌Stbl 3感受态细胞,对扩大培养的单克隆菌株抽提质粒,使用双酶切和测序验证插入序列。对真核表达载体构建正确的菌株抽提无内毒素质粒,通过慢病毒包装和感染将质粒转染至sT2细胞,通过Western Blotting检测sT2细胞中SLA-2-YT基因的表达情况。结果显示,成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体。重组质粒进行慢病毒包装和感染sT2细胞,经嘌呤霉素筛选后,成功获得阳性细胞克隆。Western Blotting检测显示SLA-2-YT/pCDH在sT2细胞中得到了优势表达,其融合蛋白的分子量大小为45 kD,与理论设计值相符。该实验成功构建了SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体,并证实了SLA-2-YT编码区基因能够在sT2细胞中优势表达,为下一步开展SLA-2-YT递呈CTL表位的研究提供了材料。

烟台黑猪SLA-I重链基因末端生物素修饰及表达

为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶切鉴定后将SLA-2-YTH-BSP复合基因与表达系统pET-28a(+)链接,并转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。表达蛋白经过Ni-NTA亲和纯化,并经SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。PCR结果显示SLA-2-BSP大小为900 bp,并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为876 bp,该基因链接到pET-28a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。成功构建烟台黑猪SLA-I重链偶合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的pET-28a(+)的重组表达系,为下一步的SLA-I类分子四聚体研究鉴定基础。

猪MHC-Ⅱ类区DQA新等位基因及新突变位点的发现

根据猪SLA DQA基因cDNA序列和人HLA DQA基因组序列设计引物 ,在猪中成功扩增了一个 731bp的片段 ,该片段包括猪SLA DQA基因的大部分第 2外显子、完整第 2内含子和少部分第 3外显子 ,通过克隆和PCR直接测序获得该片段的核苷酸序列。在家系中对第 2外显子的核苷酸序列和其编码的α1 结构域的氨基酸序列进行了分析 ,并与GenBank中所有的SLA DQA第 2外显子序列进行比较分析 ,发现有 4个新突变位点和两个新等位基因存在。新等位基因分别是DQA SLT 2 6和DQA TC 2 1 1。DQA SLT 2 6与单倍型c、d相比有 8个核苷酸的差异和 4个氨基酸的改变 :单倍型c、d在 6 0、6 5、81、93位的氨基酸分别是Val、Lys、Asp、Lys;而DQA SLT 2 6相应的氨基酸是Ala、Glu、Gly、Ile。DQA TC 2 1 1与单倍型c、d相比存在 1个氨基酸的改变 ,由单倍型c和d中 94位氨基酸His变为Tyr。

荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽及表达研究

目的:构建荷包猪SLA-2重链基因偶合底物肽(BSP)并研究其在pET-21a(+)中的蛋白表达。方法:设计荷包猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增荷包猪SLA-2-HB-BSP复合基因,并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后,将SLA-2-HB-BSP复合基因与表达系统pET-21a(+)连接,并转化BL21(Rosetta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。结果:PCR结果显示,SLA-2-BSP大小为900bp左右,并成功克隆至pMD19-T Simple Vector载体,酶切后大小为876bp,该基因连接pET-21 a(+)并转化宿主菌BL21(Rosetta)后,经诱导表达和SDS-PAGE检测,目标蛋白大小为34.4kDa,经优化后目的蛋白相对表达含量达到了45%。结论:该研究成功构建荷包猪SLA-2偶合BSP的pET-21a重组表达系,为下一步构建猪SLAⅠ类分子四聚体奠定了基础。

荷包猪SLA-2原核表达系的建立及表达研究

目的:建立荷包猪SLA-2原核表达系并研究SLA-2在pET-32中的表达。方法:设计SLA-2胞外区的表达引物,亚克隆荷包猪SLA-2的胞外区,并转化入原核表达系统pET-32进行表达,SDS-PAGE分析其表达产物的特性。结果:PCR结果显示,SLA-2胞外区亚克隆大小为840bp,酶切鉴定证实成功插入pET-32表达载体,构建重组质粒pET-32a(+)/SLA-2。SDS-PAGE显示,SLA-2基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小为51.4ku,与预期结果相符,蛋白相对表达含量达到了45%。结论:结果表明荷包猪SLA-2在pET-32系统中成功表达,蛋白表达量符合要求,可用于下一步的结构和功能检测。