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大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达 被引量:2
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作者 张秀娟 杨杰 +1 位作者 孙永强 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第12期3121-3126,共6页
为构建大约克猪 SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经 PCR 扩增获得大约克猪 SLA-1胞外区基因(命名为 SLA-1-DYKe),将此片段克隆至 pMD 19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ... 为构建大约克猪 SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经 PCR 扩增获得大约克猪 SLA-1胞外区基因(命名为 SLA-1-DYKe),将此片段克隆至 pMD 19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体 pET-28a (+)中,转化至宿主菌 BL21(DE3)进行诱导表达,用 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR 成功扩增 SLA-1-DYKe 的胞外区,得到大小为837 bp 的目的基因,目的基因成功克隆至pMD 19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了 SLA-1-DYKe/pET-28a (+)表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪 SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪 SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。 展开更多
关键词 大约克猪 sla-1 基因 原核表达载体
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实验用荣昌猪SLA-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析 被引量:1
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作者 刘弘毅 罗霆宇 +5 位作者 李昌文 于海波 路小野 陈洪岩 夏长友 高彩霞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期3064-3077,共14页
旨在明确实验用荣昌猪SLA遗传背景,深入研究SLA-1分子相关的抗原递呈和免疫应答机制,本研究对27头荣昌猪采集抗凝血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,设计特异性引物对SLA-1基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,对获得序列的分子特征进行分析... 旨在明确实验用荣昌猪SLA遗传背景,深入研究SLA-1分子相关的抗原递呈和免疫应答机制,本研究对27头荣昌猪采集抗凝血,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,设计特异性引物对SLA-1基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,对获得序列的分子特征进行分析。结果显示,荣昌猪中共获得11个SLA-1等位基因,其中,9个为新等位基因,全部获得GenBank登录号和ISAG SLA命名委员会官方命名,SLA-1^(*)24:01等位基因在该群体中频率最高。SLA-1基因编码区全长1086 bp,存在127个核苷酸多态位点,非同义单核苷酸多态性位点数高于同义单核苷酸多态性位点数。核苷酸多样度为0.0449,单倍型多样度为1,平均核苷酸差异数为48.782,G+C含量为64.9%。SLA-1基因编码的361个氨基酸中,有75个氨基酸变异位点;第2和第3外显子编码区多态性最高,且第2外显子区域的氨基酸变异程度高于第3外显子区,组成抗原肽结合槽6个口袋的33个关键氨基酸位点中,11个在人与荣昌猪之间高度保守,与β2-微球蛋白结合的19个关键氨基酸位点中,10个保持一致,CD8分子与MHC结合的关键氨基酸位点中,只有225(Thr/Ser)和228(Thr/Met)位点不同。同源性和系统进化树分析表明,SLA-1^(*)10:03和SLA-1^(*)18:03分别与人HLA-A^(*)02:01和HLA-A^(*)11:01等位基因的同源性最高,荣昌猪与亚洲野猪、巴马小型猪和融水小型猪等亚洲猪种具有较近的亲缘关系。本研究成功获得了中国地方猪种荣昌猪SLA-1基因,发现其具有极为丰富的多态性,为揭示荣昌猪的SLA遗传背景和开展异种移植研究奠定了遗传学基础。 展开更多
关键词 荣昌猪 sla-1等位基因 鉴定 分子特征
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苏紫猪SLA-1基因多态性及其抗病潜能分析 被引量:1
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作者 王泽平 王飞飞 +6 位作者 张芮铭 付言峰 赵为民 戴超辉 程金花 廖超 李辉 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1918-1927,共10页
【目的】探究苏紫猪白细胞抗原-1(swine leukocyte antigen-1,SLA-1)基因多态性,并对其抗病潜能进行分析,以期为苏紫猪分子育种提供理论基础。【方法】以苏紫猪血细胞cDNA为模板,用PCR法扩增苏紫猪SLA-1基因并测序,利用DNAStar和Mega 5.... 【目的】探究苏紫猪白细胞抗原-1(swine leukocyte antigen-1,SLA-1)基因多态性,并对其抗病潜能进行分析,以期为苏紫猪分子育种提供理论基础。【方法】以苏紫猪血细胞cDNA为模板,用PCR法扩增苏紫猪SLA-1基因并测序,利用DNAStar和Mega 5.0软件分别进行相似性分析及系统进化树构建;利用NetMHCpan 4.1 server分析SLA-1与非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗原表位结合的能力及特征;运用生物学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、结构和功能等进行预测。【结果】试验成功扩增6条苏紫猪SLA-1等位基因序列,分别为SLA-1*sz01、SLA-1*sz02、SLA-1*sz03、SLA-1*sz04、SLA-1*sz05和SLA-1*sz06,其高变异位点主要位于肽结合沟(peptide-binding groove,PBG)α1区和α2区;相似性比对结果显示,6条苏紫猪SLA-1等位基因核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.9%~96.9%、87.0%~94.8%之间,与不同品种猪核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.8%~98.8%、84.3%~98.0%之间;ASFV来源多肽结合能力的预测结果显示,SLA-1*sz01蛋白具有较强的ASFV抗原呈递能力,与ASFV来源B354L蛋白多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力;SLA-1*sz01蛋白功能域及三级结构预测结果显示,SLA-1*sz01与免疫系统相关,具有经典的SLA-1三级结构。【结论】本研究扩增得到6条苏紫猪SLA-1基因序列,其中SLA-1*sz01能够限制性结合较多的ASFV来源抗原表位多肽,与多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力,可作为苏紫猪抗病育种的候选基因。研究结果为ASFV疫苗的研发提供参考基础。 展开更多
关键词 苏紫猪 sla-1基因 多态性 抗原结合位点 抗病潜能
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大肠杆菌表达托佩克猪SLA-1胞外区的研究 被引量:1
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作者 翟晓鑫 张秀娟 +1 位作者 杨杰 高凤山 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期135-139,共5页
为构建托佩克猪SLA-1重链基因原核重组表达载体并研究其在pET-21a(+)中的表达,设计引物,PCR扩增托佩克猪SLA-1基因胞外区(命名为SLA-1-TPKe),并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后将SLA-1-TPKe基因与表达系统pET-21a(+)连接,转化... 为构建托佩克猪SLA-1重链基因原核重组表达载体并研究其在pET-21a(+)中的表达,设计引物,PCR扩增托佩克猪SLA-1基因胞外区(命名为SLA-1-TPKe),并克隆至pMD19-T Simple Vector,经酶切鉴定后将SLA-1-TPKe基因与表达系统pET-21a(+)连接,转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。提取SLA-1-TPKe包涵体,并经SDSPAGE检测。PCR结果显示,SLA-1-TPKe大小为851 bp,成功克隆到pMD19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为831 bp,连接到pET-21a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为31 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。 展开更多
关键词 托佩克猪 sla-1 重链基因 表达 包涵体
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猪SLA-1分子结合多肽特性分析及功能验证 被引量:1
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作者 巴利民 王振豹 +3 位作者 齐鹏 汪明 肖进 喻长远 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第10期46-48,共3页
本文利用软件对我国商品猪群中表达频率较高的SLA-1*080101等位基因进行分析,找出了该等位基因所呈递的多肽抗原的第2位和第9位氨基酸的偏好性,确定该等位基因的结合多肽残基基序为:X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。再结合表位预测... 本文利用软件对我国商品猪群中表达频率较高的SLA-1*080101等位基因进行分析,找出了该等位基因所呈递的多肽抗原的第2位和第9位氨基酸的偏好性,确定该等位基因的结合多肽残基基序为:X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。再结合表位预测软件,预测了6条口蹄疫病毒CTL表位,并通过动物试验验证,确定其中2条具有较强的细胞免疫反应(P1和P4)。本试验结果为开发口蹄疫细胞免疫疫苗,完善现有产品保护性能提供了科学依据。 展开更多
关键词 sla-1 口蹄疫 结合多肽残基基序 CTL表位
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猪SLA-1体外表达及其结合多肽的筛选 被引量:1
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作者 巴利民 王振豹 +3 位作者 齐鹏 汪明 肖进 喻长远 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第12期32-35,共4页
本文将猪群中表达频率较高的SLA-1*1301胞外区及SLA-β2 m基因序列片段合成后连接到pET21a(+)原核表达载体上,构建出pET21a-SLA-1*1301和pET21a-SLA-β2m重组表达质粒。通过IPTG诱导大肠杆菌刺激产生大量的相关目标产物,再将所获得的质... 本文将猪群中表达频率较高的SLA-1*1301胞外区及SLA-β2 m基因序列片段合成后连接到pET21a(+)原核表达载体上,构建出pET21a-SLA-1*1301和pET21a-SLA-β2m重组表达质粒。通过IPTG诱导大肠杆菌刺激产生大量的相关目标产物,再将所获得的质量比较高的SLA-1*1301胞外区表达蛋白、SLA-β2m蛋白分别与6条软件预测的口蹄疫细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位多肽进行蛋白复性和纯化,通过蛋白纯化仪分析,结果显示,其中4条预测口蹄疫CTL表位多肽可以形成稳定的SLA I-β2m-表位多肽复合体,表明该4条多肽可能为口蹄疫的CTL表位肽,对将来开发细胞免疫疫苗和相关免疫增强剂有重要的指导意义。 展开更多
关键词 sla-1 口蹄疫 CTL表位
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托佩克猪SLA-1-632-TPK基因的矫正及重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T的构建
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作者 翟晓鑫 高花 +1 位作者 韩勇 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第6期1645-1651,共7页
猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失(距离SLA-1-632-TPK基因5′端632bp处丢失1个碱基&quo... 猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失(距离SLA-1-632-TPK基因5′端632bp处丢失1个碱基"C"),导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR(splicing overlap extention PCR,SOEPCR)技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5′和3′端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5′和3′端片段,大小约为650和590bp,与理论设计值大小(648和585bp)接近,经过拼接以后,得到全长约1 200bp,与理论设计值1 223bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5′端632bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。 展开更多
关键词 托佩克猪 sla-1基因 基因矫正 剪切重叠延伸PCR(SOE-PCR)
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荷包猪SLA-1重链四聚体前体链的构建及表达研究 被引量:1
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作者 高花 郭杨 +2 位作者 翟晓鑫 张宗辉 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第12期3453-3458,共6页
试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1(swine lymphocyte antigen 1,SLA-1)重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a(+)中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C... 试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1(swine lymphocyte antigen 1,SLA-1)重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a(+)中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列(BirA substrate peptide,BSP)。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a(+)连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876bp。阳性克隆菌株与pET-21a(+)表达载体经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a(+)重组表达体系,为下一步进行猪SLAⅠ类分子四聚体的检测奠定基础。 展开更多
关键词 荷包猪 猪白细胞抗原1 四聚体 可生物素酰化序列
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猪肾上皮细胞SLA-1基因的克隆及分子结构特征分析
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作者 王宝宝 金行 +2 位作者 鲜钰涵 冯宏盛 高凤山 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1671-1678,共8页
【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用D... 【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】RT-PCR扩增获得约1400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1419 bp,其中2-1087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性氨基酸变异位点。PK15细胞SLA-1蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主。同源建模结果显示,SLA-1蛋白具有SLA classⅠ典型的三级结构,α1区和α2区构成抗原多肽结合区。【结论】SLA-1基因稳定存在于PK15细胞,PK15细胞具有作为SLA-1抗原表位筛选系统的潜在应用价值。 展开更多
关键词 猪肾上皮细胞15(PK15) 猪白细胞抗原1(sla-1) 克隆 生物信息学分析 同源模建
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地方三品系猪SLA-1原核表达载体构建及表达研究 被引量:4
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作者 严婷婷 苟东州 +1 位作者 董宋鹏 高凤山 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期16-19,共4页
目的:为研究我国地方三品系猪SLA-1原核表达。方法:选取3个国内地方品系猪荷包、烟台黑猪及莱芜黑猪的SLA-1等位基因,PCR扩增地方品系猪SLA-1胞外区基因,再将胞外区基因克隆至pMD19-T Simple Vector,阳性重组子经过酶切,然后连接至pET... 目的:为研究我国地方三品系猪SLA-1原核表达。方法:选取3个国内地方品系猪荷包、烟台黑猪及莱芜黑猪的SLA-1等位基因,PCR扩增地方品系猪SLA-1胞外区基因,再将胞外区基因克隆至pMD19-T Simple Vector,阳性重组子经过酶切,然后连接至pET-21a载体,构建其原核表达载体,并转化宿主菌BL21进行诱导表达。结果:PCR结果显示三个品系猪SLA-1胞外区大小约840bp,经克隆后成功连接至pMD19-T Simple Vector,经酶切回收后插入片段又成功连接至pET-21a载体,并在BL21成功表达,表达蛋白大小约31 kDa,与设计值大小相符。蛋白表达量约5%。结论:该研究成功表达了我国三个地方品系猪SLA-1胞外区,为下一步研究其空间结构及功能奠定基础。 展开更多
关键词 sla-1 原核表达 载体
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Study of Swine Leukocyte Antigen Class I-3 (SLA-3) Gene for Inbreeding Wuzhishan Pig 被引量:1
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作者 SUN Jun-li MU Wu-lian +2 位作者 LIU Xiao-lin FENG Shu-tang WANG Su-rong 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2007年第12期1502-1510,共9页
To elucidate the structure of SLA-3 alleles on inbred line of Wuzhishan pig (WZSP) population, we examined the partial exon 1, completed exon 2, and partial exon 3 of SLA-3 loci using the reverse transcription-polym... To elucidate the structure of SLA-3 alleles on inbred line of Wuzhishan pig (WZSP) population, we examined the partial exon 1, completed exon 2, and partial exon 3 of SLA-3 loci using the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT- PCR) and the sequencing-based method in 32 WZSPs. According to pedigree and amplification results, PCR products of 8 WZSPs were selected to clone and sequence. Nine different nucleotide sequences were obtained. After comparing the DNA and protein sequences of the WZSPs SLA-3 alleles with the published GenBank SLA sequences, it was found that the SLA-3 alleles in WZSPs were all novel, but there were very few variations among them. Comparision of SLA-3 and HLA-A protein sequences indicated that there was more sequence homology. Meanwhile, the construction of a phylogenetic tree using the nucleotide sequences of 23 SLA-3 alleles and 1 HLA-A allele represented that the WZSP population owns its unique genetics resource. In this study, the alleles of SLA-3 on WZSP group were successfully detected and analyzed, which provided the firm basis on the genotype of SLA-3 for breeding specific haplotypes WZSPs. 展开更多
关键词 inbreeding Wuzhishan pig leucocyte antigen SLA classical class 1-3 gene RT-PCR
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乙型肝炎后肝硬化自身抗体检测及其对肝功能影响的研究 被引量:18
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作者 王波 丁楠 常波 《中国实验诊断学》 2013年第11期2022-2025,共4页
目的探讨乙型肝炎后肝硬化患者血清中自身抗体存在的情况及其对肝功能的影响。方法利用间接免疫荧光法及免疫印迹法分别检测89例乙型肝炎后肝硬化(HBC)患者及64例慢性肝炎患者(CHB)血清中自身抗体阳性率,将两组阳性率进行统计比较。将89... 目的探讨乙型肝炎后肝硬化患者血清中自身抗体存在的情况及其对肝功能的影响。方法利用间接免疫荧光法及免疫印迹法分别检测89例乙型肝炎后肝硬化(HBC)患者及64例慢性肝炎患者(CHB)血清中自身抗体阳性率,将两组阳性率进行统计比较。将89例HBC患者按照自身抗体存在情况分成自身抗体阳性组和自身抗体阴性组,利用全自动生化分析仪分别检测两组患者的肝功指标,并与90例正常对照者(正常对照组)进行比较。结果乙型肝炎后肝硬化组自身抗体检出情况与慢性乙型肝炎组相比,AMA、AMA-M2升高最为明显(P<0.01),ANA检出率也显著增高(P<0.05),其他指标差异无统计学意义(P>0.05)。肝功能指标中,自身抗体阳性组与阴性组比较,ALP升高最为明显(P<0.01),AST、TBA值显著升高(P<0.05),其他指标差异无统计学意义(P>0.05)。自身抗体阳性组与正常对照组比较,ALT、AST、TBil、DBil、GGT、ALP、TBA值均显著升高(P<0.01)。自身抗体阴性组与正常对照组比较,ALT、AST、TBil、GGT、TBA及DBil显著升高(P<0.01或P<0.05),ALP值差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙型肝炎后肝硬化患者合并自身免疫性肝病对肝脏损害更大,在肝病患者中检测自身抗体将有助于判断肝病患者病情的严重程度和预后。 展开更多
关键词 乙型肝炎后肝硬化 抗核抗体 抗线粒体抗体 抗线粒体抗体M2亚型 抗肝肾微粒体抗体1型抗体 抗肝 细胞溶质抗原1型抗体 抗可溶性抗原 肝胰抗原
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