黏质沙雷氏菌诱导的黄喉拟水龟SMART cDNA文库构建及相关基因的鉴定

以致病黏质沙雷氏菌人工感染的黄喉拟水龟肝组织为材料,应用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,构建了黄喉拟水龟的全长cDNA文库。首先用SMARTTM PCR cDNA systhesis kit合成全长的双链cDNA,通过琼脂糖凝胶分级分离技术切除小片段的cDNA,将大于500 bp的cDNA连接到pGEM-T载体中,电转化到J M109感受态细胞。在构建好的文库中,经测定,文库约含有1.8×105个重组子,重组效率达90%,插入片段多在0.5～3.0 kb之间。对库中长度约为1 000 bp的80个基因进行了测序,结果显示大部分首次在龟类发现。测序鉴定的基因包括免疫相关基因9个、信号传导基因6个、催化酶类基因8个、糖代谢相关基因2个、转运相关基因1个、结构基因2个。

应用Super SMART cDNA合成技术扩增哮喘嗜酸性粒细胞总RNA

目的应用Super SMART cDNA 合成技术从嗜酸细胞微量总RNA扩增大量双链cDNA。方法利用Percoll密度梯度离心分离哮喘病人血嗜酸性粒细胞,用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,利用Super SMART cDNA合成技术合成cDNA第1链及优化扩增第2链。通过梯度电泳鉴定cDNA产品质量,通过对获得的cDNA定量来评估扩增效能。结果从20 ng总RNA成功扩增出双链cDNA 7.155 μg,电泳结果显示cDNA质量及纯度较高。结论Super Smart cDNA 合成技术可实现从微量总RNA高效扩增高质量的cDNA,为进一步从基因水平研究哮喘机制奠定了基础。

Construction of SMART cDNA Library of Sheep Ovary and Identification of Candidate Gene by Homologous Cloning

The cDNA library of an ovary from Small Tail Han sheep before estrus was constructed by switching mechanism at 5＇ end of RNA transcript （SMART） approach. This library had a plaque titer of 1 x 109 pfu mL-1 and a 96% recombinant ratio of which the fragment length of inserted average cDNA sequences was 1.0 kb. Based on bioinformatics analysis of the sequences, we obtained 338 expressed sequence tags （ESTs） from 380 cDNA clones which indicated 191 contigs. These contigs consist of 89 unmatched ESTs, 9 homologous known genes in sheep, and 93 homologous sequences in species of mouse, bovine, and human beings, including 19 sequences expressed in the ovary or follicle and 14 unknown sequences. Several candidate genes associated with sheep reproduction trait such as epidermal growth factor （EGF）, estrogen receptor （ESR）, Inhibin, follicle stimulating hormone receptor （FSHR）, prostaglandin （PG）, and transforming growth factor-β （TGF-β） were identified and the homologous were cloned from this library, which will contribute to compile expression profiles and find the major genes of prolificacy of Small Tail Han sheep.

应用Super SMART cDNA合成技术扩增油松胚珠总RNA

以油松雌性不育突变体和具有相似遗传背景可育系的胚珠为材料,用Plant RNA assistant kit试剂盒提取油松总RNA,采用Super SMART cDNA合成技术合成cDNA第l链,优化扩增第2链,通过设置梯度PCR扩增循环数,电泳分析后鉴定cDNA质量,采用定量法评估其扩增效率。可育系和不育系各1μg总RNA分别成功扩增出46.06和43.59μg纯化的双链cDNA,质量及纯度较高。此方法的应用解决了研究材料有限的问题,可由微量的胚珠总RNA扩增出足够多的高质量双链cDNA,为今后抑制性消减杂交文库的构建奠定基础。

应用SMART cDNA合成技术富集鸡脾脏微量RNA

以鸡脾脏中提取的20ng微量RNA为起始样本,应用SMART cDNA合成技术合成cDNA第一链及扩增第二链,并在原有基础上做了适当的优化和改进。同时与传统cDNA合成方法进行了比较。最终,从20ng总RNA中成功扩增出双链cDNA6.03μg,而采用传统方法只合成出0.03μg cDNA,且前者cDNA的质量和纯度明显高于后者。结果表明,通过SMART cDNA合成技术,可使鸡脾脏微量RNA得到有效地富集。

麦根腐平脐蠕孢cDNA文库的构建及BsTup1互作蛋白筛选

【目的】深入探究麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)生长发育及致病力的分子作用机制,并鉴定BsTup1的互作蛋白。【方法】利用麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)孢子和不同时期的菌丝体为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以BsTup1基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与BsTup1相互作用的蛋白。【结果】1)利用SMART(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)技术首次成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokini-ana)分生孢子和菌丝体的混合cDNA文库。文库鉴定结果表明,构建的cDNA文库库容为4.8×10^(7) cfu·mL^(-1),文库插入片段重组率达100%且平均大小为1000 bp。2)构建了pGBKT7-BsTup1诱饵载体,无自激活活性。3)使用诱饵蛋白载体pGBKT7-BsTup1对麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)酵母双杂交cDNA文库进行筛选,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。【结论】成功构建了麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana)的cDNA文库,并鉴定出38个与BsTup1相互作用的候选蛋白。

SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。

一种获得大片段克隆的SMART全长cDNA文库构建方法

针对SMART方法中PCR扩增削减了大片段基因所占比例，使文库中很难获得大片段克隆的问题，进行了方法改进。在原始SMART方法的基础上，以大豆叶片为材料，通过琼脂糖凝胶分级分离技术，将PCR扩增后合成的dscDNA分成3个等级，分别与载体连接、转化，构建相应亚库，每个亚库容量在1．0×10^6左右，重组率接近99％。改进方法所建文库的平均全长率53．6％，与改进前的（52．2%）相当。插入片段范围为0．5～3．5kb，最大插入片断长度比改进前的提高1．5kb。该方法提高了SMART方法中大片段克隆的获得率，为大豆功能基因组学研究提供了保障。

利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库

以烟草不同生长时期茎混合为材料,采用SMART(switching mechanism at5'end of RNA transcript)技术构建了茎全长cDNA文库.原始文库的库容为5.64×106个独立克隆,重组率达99%以上,插入片段集中在0.75-2.0 kb之间,平均长度约为1.2 kb.随机挑取部分克隆进行测序,并进行生物信息学分析,37.5%的序列烟草已有报道,62.5%为烟草未报道的基因,45.8%是未知功能的基因,表明所构建文库达到了用于目的基因分离筛选和新基因克隆的建库要求.

SMART技术构建栀子cDNA文库

目的:构建栀子叶片cDNA文库。方法:提取栀子叶片总RNA。利用SMART技术合成双链cDNA。双链cDNA经限制酶Sfil酶切后与pDNR-LIB质粒连接。利用电刺激转化法将重组质粒导入E.coli DH5α而获得文库。利用PCR法检测文库的重组率。结果:原始文库滴度为2.63×105cfu/ml。随机检测文库中的15个克隆,表明重组率约为86.7%。选择14个插入片段的长度在400bp以上的克隆进行测序和生物信息学分析,结果预测的全长基因占所检测序列的64.3%。结论:成功构建了栀子叶片的cDNA文库,为栀子基因的结构和功能的研究提供了基础。

用SMART技术构建猪蛔虫雌虫cDNA文库

为克隆出与猪蛔虫产卵或发育相关基因的全长序列,本研究根据SMART(Switching mechanism at5'end of RNA transcript)技术,采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库。用TriPure Isolation Reagent和Poly(A)PuristTM试剂盒提取mRNA后,以逆转录酶PowerScriptTM反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA。扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400TM柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB(带有SfiⅠA和B两个位点)质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH5α内得到原始文库,扩增后的文库保存在96孔细胞培养板中。经测定,构建的cDNA文库约含有1.6×106个重组子,重组效率达100%,插入片段多在0.4kb～2kb之间,平均插入片段长度约1.2kb,扩增后文库滴度为3×109CFU/mL。结果表明猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库已构建成功,从而为筛选猪蛔虫雌虫的功能基因全长序列奠定了基础。

利用SMART技术构建白菜型油菜cDNA文库

作者用SMART技术构建了芸苔属三个基本种之一———白菜型油菜的cDNA文库 .所构建的cDNA文库滴度为 1.0 2× 10 6 pfu/mL ,重组率为 82 % .扩增后文库的滴度为 7×10 12 pfu/mL .利用PCR方法扩增插入片段 ,其长度在 50 0bp～ 1.5kb之间 .

利用SMART技术构建疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库及芋螺毒素新基因的克隆

利用RNA 5'末端移动反转录(switching mechanism at 5'end RNA transcription,SMART)技术构建及鉴定疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库,克隆新型芋螺毒素基因.提取疣缟芋螺毒管总RNA,用RT-PC反转录成单链cDNA(single-stranded cDNA,ss-cDNA),长距离PCR(long-distance PCR,LD-PCR)扩增合成双链cDNA(double-stranded cDNA,ds-cDNA),依次用蛋白酶K和SfiⅠ酶进行酶切孵育,用CHROMA SPIN-400柱进行分级分离.得到的ds-cDNA与λTripIE×2噬菌体载体体外连接并体外包装,感染大肠杆菌E.coli XL1-blue,测定原始文库滴度和重组率.进行文库扩增,测定扩增文库滴度.用PCR鉴定插入cDNA片段的大小,构建的疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体原始文库滴度为1.47×106pfu/mL,重组率为90.72%,扩增文库的滴度为4.07×108pfu/mL,插入cDNA片段为200～1 200 bp.利用SMART技术成功构建了疣缟芋螺毒管cDNA噬菌体文库并克隆出新型芋螺毒素基因,为芋螺毒素基因的筛选和鉴定奠定了基础.

SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库

目的构建红曲霉cDNA文库，为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。方法采用SMART（ switching mechanism at 5 ＇end of RNA transcript）技术构建红曲霉全长cDNA文库，经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。结果原始文库的库容为2．03×10^5，重组率达94％。插入片段大小多在0．7—2．0kb，平均大小在1kb左右。结论所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。

用SMART技术构建扩展莫尼茨绦虫成虫全长cDNA文库

利用SMART(switching mechanismat 5′end of RNA transcript)技术,采用Clontech公司的SMARTTMcDNALi-brary Construction Kit构建扩展莫尼茨绦虫成虫全长cDNA文库。用Trizol Reagent提取总RNA,用Oligotex mRNA Kits分离mRNA,以逆转录酶PowerScriptTM合成第一链cDNA,通过LD-PCR合成并扩增双链cDNA;扩增产物经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、过SPIN-400TM柱去除小片段,连接到SfiⅠ消化过的pBluescriptⅡSK*质粒载体中,最后将重组质粒转化到E.coliDH5α内得到原始文库,扩增后,将文库保存于96孔细胞培养板中。经测定,构建的cDNA文库滴度为2.52×105PFU/mL;重组率为94.7%,插入片段长度多在0.5～3kb之间,平均长度约1.2kb。经5′端测序获得2642条有效序列,归并为1081条unigene。结果表明成功构建了扩展莫尼茨绦虫成虫全长cDNA文库,获得了较丰富的扩展莫尼茨绦虫成虫表达基因,为筛选扩展莫尼茨绦虫的功能基因全长序列奠定了基础。

悦目金蛛丝腺SMART RACE cDNA文库的构建与鉴定

运用SMART技术构建了悦目金蛛丝腺SMARTRACEcDNA文库。经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500bp～2000bp之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752bp的全长cDNA序列。以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE,3’RACE和5’RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致。结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA。本文还对SMART技术的特点和局限性进行了讨论。

利用SMART技术构建珙桐叶片全长cDNA文库

以珙桐叶片为研究材料，用Rneasy Plant Mini Kit提取珙桐叶片组织总RNA，反转录成单链cDNA，长距离PCR方法合成双链cDNA；PCR产物经蛋白酶K消化、SfiI酶切后，采用CHROMA SPIN-400柱分级分离，回收0．5kb以上的cDNA组分，以λTriplEx2载体连接并进行体外包装，构建了珙桐叶全长cDNA文库．结果表明：以XL1-Blue、BM25．8为受体菌测定的原始文库滴度为8．3×10^6pfu／mL，扩增后文库总滴度为4．16×10^8pfu／mL，重组率为97．3％；对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，表明插入片段大多分布在0．5～2．0kb之间，文库质最较高．这为进一步开展珙桐EST测序分析、目的基因克隆及功能基因组学研究奠定了基础．

利用SMART技术构建新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库

【目的】探寻控制羊毛性状的相关基因,构建了新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库。【方法】采用Clontech公司的CreaterTM SMARTTM cDNA library construction kit,用Biozol试剂提取新吉细毛羊皮肤组织总RNA后,以反转录酶SuperscriptTMⅡ反转录为第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA,扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB（带有SfiⅠA和B 2个位点）质粒载体中,最后用热击转化法将重组质粒转化到E.coliDH5α内,得到新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA原始文库,扩增后的文库分装后用50 mL离心管保存。【结果】构建的cDNA文库约含4.2×105个独立克隆,重组效率为100%,插入片段多为0.5～3.0 kb,平均插入片段长度为1.3 kb,符合建库要求。【结论】经检测所构建的文库库容量满足基因筛选要求,可用于特异表达基因全长序列。

利用SMART技术构建中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库

目的:针对人类肝脏蛋白质组计划中大规模基因克隆及构建肝脏蛋白相互作用图谱的研究需要,改造酵母双杂交载体pPC86和pDBleu,并构建中国人肝组织cDNA文库,为肝脏蛋白质组计划的研究奠定基础。方法:设计并合成特定寡核苷酸序列,经过处理形成具有黏性末端的双链DNA片段,插入到pPC86、pDBLeu载体相应的酶切位点处,从而获得改造的新载体。利用改造后的载体、中国人正常肝组织mRNA和Clontech公司SMART文库构建试剂盒构建NpDBLeu-cDNA文库。结果:酶切鉴定和DNA测序证实改造后载体插入位点和序列正确,成功获得新载体NpPC86和NpDBLeu。滴度测试表明,所构建NpDBLeu肝组织cDNA文库容量为1.93×106cfu,转化子重组效率为95.2%,扩增文库达到109cfu·mL-1。结论:利用SMART技术成功构建了中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库。