LINE-1 ORF-1p过表达对肝癌细胞株SMMC7721增殖和锚定非依赖性生长的影响

目的研究逆转座子L1编码蛋白ORF-1p的表达对肝癌细胞株SMMC7721细胞增殖的影响。方法利用带Flag标签的L1 ORF1表达载体,转染SMMC7721细胞;采用Western blot法检测反转座子L1 ORF1编码蛋白ORF-1p的表达;采用软琼脂成集落实验和相关报告基因检测ORF-1p表达对肝癌细胞p53、p15和p21活性的影响。结果在SMMC7721细胞中,Flag-ORF-1p表达能够显著促进该细胞的增殖(P<0.05),增强该细胞的锚定非依赖性生长(P<0.05),降低p53、p15和p21报告基因的活性。结论 L1基因编码蛋白ORF-1p能够促进肝癌细胞的生长、浸润以及肿瘤的形成。

siRNA沉默新趋化因子VCC-1抑制SMMC7721肝癌细胞体外克隆形成能力和体内成瘤性

目的:探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC27721成瘤性的影响。方法:用软琼脂克隆形成实验、裸鼠成瘤实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞克隆形成能力及裸鼠成瘤性的影响。结果:软琼脂克隆形成实验结果显示siRNA靶向抑制VCC-1表达可显著降低SMMC7721肝癌细胞的克隆形成能力(P<0.01);裸鼠成瘤实验显示注射shVCC1-1组肝癌细胞的裸鼠,比注射干扰阴性对照shNC组肝癌细胞及未处理对照组肝癌细胞的裸鼠的瘤体生长速度慢,瘤体重量轻、体积小(P<0.01)。结论:siRNA抑制VCC-1在SMMC7721中的表达,在一定程度上可以抑制其体外克隆形成能力及体内成瘤性。

siRNA沉默MAPK p42对肝癌SMMC7721增殖和凋亡的影响

目的应用siRNA沉默SMMC7721细胞MAPK p42,并观察其对增殖和凋亡的影响。方法应用SilencerTMsiRNA构建试剂盒合成2条MAPK p42siRNAs和一条随机对照siRNAs,用脂质体LipofectaminTM 2000将其转染入肝癌SMMC-7721细胞株。应用Western blot检测MAPK p42表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期及其细胞凋亡。结果与对照相比,MAPK p42siRNA明显抑制MAPK p42表达。MAPK p42siRNA抑制了SMMC-7721细胞的生长,将细胞阻滞于细胞周期S期,进而诱导了细胞凋亡的发生。结论 MAPK p42靶向siRNA可能为肝癌基因治疗的重要手段。

Survivin在槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡中的调节作用研究

目的研究槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡,探讨其诱导SMMC7721细胞凋亡与survivin蛋白表达和caspase-3活性的关系。方法采用MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用,Hoechst 33258荧光染色对细胞凋亡进行形态学检测,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学检测survivin蛋白表达,分光光度法检测caspase-3的活性变化。结果槲皮素抑制肝癌SMMC7721细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48 h的IC50为84.24μmol.L-1。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经槲皮素处理,肝癌SMMC7721细胞周期阻滞于G0/G1期,且SMMC7721细胞survivin蛋白表达下降,caspase-3活性升高。结论槲皮素能诱导SMMC7721细胞凋亡,其机制可能是使肝癌SMMC7721细胞周期阻滞于G0/G1期,并下调survivin蛋白的表达,直接激活caspase-3而诱导SMMC7721细胞凋亡。

紫杉醇对肝癌SMMC7721细胞凋亡的诱导作用及对相关基因表达的影响

目的:探讨紫杉醇对肝癌SMMC7721细胞凋亡的诱导作用及对bcl-2和bax基因的影响。方法:用浓度为5μg·ml^(-1)的紫杉醇处理肝癌SMMC7721细胞后,利用DNA琼脂糖凝胶电泳,TUNEL法检测其细胞凋亡;通过原位杂交法、免疫组化法,测定紫杉醇诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡时,凋亡抑制基因bcl-2和凋亡促进基因bax的mRNA和蛋白表达。结果:紫杉醇作用一定时间后,SMMC7721细胞产生凋亡、bcl-2显著下降、bax表达显著增高。结论:紫杉醇通过调节细胞凋亡抑制基因bcl-2和细胞凋亡促进基因bax的作用,从而诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡。

siRNA介导的新趋化因子VCC-1沉默对人SMMC7721肝癌细胞生长的影响

目的探讨siRNA靶向抑制VCC-1表达对人肝癌细胞株SMMC7721生长的影响。方法采用脂质体法将siRNA质粒导入SMMC7721细胞,建立VEGF相关的趋化因子1(VCC-1)基因表达沉默的肝癌细胞系,用Western blot检测细胞中VCC-1的表达水平,用MTT法、软琼脂克隆形成实验等研究siRNA靶向抑制VCC-1表达对SMMC7721细胞生长的影响。结果Western blot结果显示RNA干扰组(shVCC1-1组)细胞VCC-1蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.01),MTT法结果显示shVCC1-1组细胞增殖速度、克隆形成率均低于对照组(P<0.05)。结论 siRNA靶向抑制VCC-1表达可以抑制人SMMC7721肝癌细胞增殖能力及克隆形成能力。

白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡过程中bax和bcl-2基因表达

目的探讨中药白英提取物对肝癌SMMC7721细胞中细胞凋亡相关基因的影响。方法用不同浓度的白英提取物处理肝癌SMMC7721细胞,利用TUNEL法检测其细胞凋亡;通过原位杂交法、免疫组化法,研究白英提取物诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡时,凋亡促进基因bax和凋亡抑制基因bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果 IPP图像分析表明,bax表达显著增高,bcl-2显著下降。结论白英提取物通过调节细胞凋亡促进基因和抑制基因,从而诱导肝癌SMMC7721细胞产生凋亡。

KPNA2基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵袭能力的影响

目的观察核转运蛋白基因α2(Karyopherinα-2,KPNA2)基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及侵袭能力的影响。方法将KPNA2 siRNA干扰质粒用LipofectaminTM 2000方法瞬时转染人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404,转染后48 h应用蛋白质印迹法检测转染细胞中KPNA2蛋白表达。采用MTT法检测基因沉默细胞增殖能力,采用Transwell法检测基因沉默细胞侵袭能力。结果 SMMC7721细胞株对照组mRNA为1.02±0.13,高于siRNA转染组的0.37±0.07(t=10.78,P<0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组mRNA为1.05±0.17,高于siRNA转染组的0.36±0.06(t=9.38,P<0.01)。肝癌SMMC7721细胞株对照组蛋白定量值为0.96±0.10,高于转染组的0.42±0.05(t=11.83,P<0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组蛋白定量值为0.93±0.09,高于转染组的0.48±0.06(t=10.19,P<0.01)。SMMC7721和Bel7404细胞株在24、48和72 h时对照组增殖能力高于转染组,且差异有统计学意义(P<0.05)。SMMC7721细胞株对照组侵袭能力值为126.20±21.61,高于siRNA转染组的51.13±10.2(t=7.68,P<0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组侵袭能力值为125.124±8.04,高于siRNA转染组的55.20±18.54(t=8.48,P<0.01)。结论KPNA2基因沉默可以调节人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵袭能力。

三种中草药对人肝癌细胞SMMC7721体外增殖抑制

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和细胞凋亡形态观察,初步探讨白英、毛麝香和使君子3种中草药的醇提物对肝癌细胞SMMC7721体外增殖的抑制效果.结果表明,白英醇提物对肝癌细胞SMMC7721有很强的抑制作用,当抑制率为50%时,样品的质量浓度(5ρ0)达到25.85 mg.L-1,且经50 mg.L-1作用72 h后,细胞逐渐变圆,体积缩小,有凋亡小体形成,呈典型的凋亡现象;使君子、毛麝香的醇提物对细胞抑制作用较弱,在药物质量浓度达到100 mg.L-1时,对SMMC7721细胞的抑制率分别为43.88%,20.88%,二者的5ρ0均大于100 mg.L-1.

腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响

目的:构建蛋白酶体亚基α3(proteasome subunit alpha type 3,PSMA3)基因腺病毒重组载体,并观测腺病毒介导PSMA3基因过表达对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期、凋亡及其荷瘤生长的影响。方法:RT-PCR法扩增PSMA3基因全长CDs序列后,克隆入pTG19-T载体,再亚克隆入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,构建重组pAdTrack/PSMA3腺病毒载体,随后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组形成p Ad/PSMA3重组腺病毒,经包装及滴度测定,获高感染力的pAd/PSMA3病毒。用pAd/PSMA3病毒感染人肝癌SMMC7721细胞,荧光显微镜观测被感染的SMMC7721细胞的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的变化情况。Cell counting kit-8(CCK-8)法检测pAd/PSMA3病毒对SMMC7721细胞增殖的影响。Real-time PCR和Western blot分别检测被感染的SMMC7721细胞的PSMA3基因、增殖细胞核抗原基因(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Caspase-3促凋亡基因及其编码蛋白的表达情况。流式细胞仪(FCM)检测被感染的SMMC7721的周期、凋亡变化。将经pAd/PSMA3病毒感染的SMMC7721细胞移植裸鼠皮下以生成荷瘤,逐日观察荷瘤的生长情况。所有实验以空病毒感染及未感染的细胞做对照。结果:克隆到768 bp的PSMA3基因,并构建了其具高感染力的pAd/PSMA3重组病毒。CCK-8法结果表明,过表达PSMA3基因的SMMC7721细胞,其增殖明显减慢(P<0.05)。Real-time PCR、Western blot检测显示,pAd/PSMA3重组病毒可介导SMMC7721细胞过表达PSMA3基因,上调其Caspase-3基因及其编码蛋白的表达,并下调其PCNA基因及其蛋白的表达(P<0.05)。FCM检测证实,过表达PSMA3基因的细胞可被阻滞于G1期(细胞周期),并可促使其凋亡,其凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。动物实验证实,p Ad/PSMA3病毒可明显抑制裸鼠荷瘤的生长(P<0.01)。结论:重组病毒pAd/PSMA3可将SMMC7721细胞阻滞于G1期(细胞周期),抑制其增殖,促使其凋亡,并可抑制其裸鼠荷瘤的生长,这些可能和下调其增殖相关PCNA蛋白,上调其凋亡相关caspase-3蛋白的表达密切相关。

青蒿琥酯抗肝癌作用的实验研究

目的 :研究青蒿琥酯的抗肝癌作用。方法 :运用小鼠肝癌H2 2 癌模型、MTT法和集落形成法 ,观察青蒿琥酯对荷瘤鼠和人肝癌SMMC 772 1细胞株的作用。结果 :口服青蒿琥酯 30 0mg·kg-1·d-1,肿瘤受到明显抑制 ,抑瘤率在 3次实验中分别为 49.1% ,48.7% ,46 .6 % ;小鼠生存时间明显延长。青蒿琥酯与 5 氟尿嘧啶有协同抗肿瘤作用。青蒿琥酯体外对人肝癌细胞有明显细胞毒作用 ,其IC50 为 2 .0 7μg·ml-1,同时抑制人肝癌SMMC 772 1克隆原细胞形成集落 ,其IC50 为 2 .48μg·ml-1。结论

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的：构建表达新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。方法：以野生型鸡痘病毒(fowl poxvirus,FPV)282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5-溴-2-脱氧尿苷(5-bromo-2-deoxyribouri- dine,BrdU)加压法筛选重组体,并通过RT-PCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。结果：成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43．37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20．65%。结论：重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。

靶向STAT5的RNAi重组质粒的构建与鉴定

目的构建靶向信号转导及转录激活因子5(STAT5)的RNAi重组质粒并进行鉴定。方法设计针对STAT5编码区的有短发夹结构的3对DNA序列,克隆到质粒载体Pgenesil-1中构建重组质粒,再对其进行酶切鉴定、DNA测序分析。脂质体法转染重组质粒至SMMC7721细胞株中,western-blot、RT-PCR检测STAT5基因表达。结果酶切鉴定和测序分析提示,靶向STAT5的RNAi重组质粒构建成功,3条靶向STAT5的序列特异性小发夹状RNA(shRNA)可有效抑制SMMC7721细胞STAT5表达,mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,蛋白质表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%(P<0.05)。其中以Pgenesil-1-STAT5A1抑制效应最强。结论成功构建靶向STAT5的RNAi重组质粒,为进一步用该重组干扰载体进行体内肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。

树舌多糖GF对肝癌细胞的增殖抑制作用及对RB基因mRNA表达的影响

目的:研究树舌多糖GF对肝癌细胞的增殖抑制作用以及对RB基因mRNA表达的影响。方法:利用CCK-8法观察树舌多糖GF对肝癌细胞增殖抑制作用,并筛选出有效剂量;以SMMC7721为研究对象,在mRNA水平探究其对RB基因表达的影响。结果:CCK-8法表明,树舌多糖GF各剂量组和对照组比较,OD490nm均明显降低,有显著性差异(P<0.01),其中树舌多糖GF2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL剂量组对SMMC7721细胞增殖的抑制效果最强,抑制率分别是20.01%、20.47%、24.44%。结论:树舌多糖GF可明显上调RB基因的mRNA表达水平,从而实现对肝癌细胞的增殖抑制作用。

干扰素-α对肝癌细胞增殖与凋亡的影响

目的:研究干扰素-α对人肝癌SMMC7721细胞的增殖及迁移的抑制作用,探讨其抗肿瘤作用的机制。方法:常规培养的人肝癌SMMC7721细胞,加入干扰素-α孵育24 h后,以MTT法检测干扰素-α对肿瘤细胞增殖的影响;Boyden小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化,通过Annexin V-FITC检测干扰素-α诱导SMMC7721细胞组的凋亡情况。结果:干扰素-α可以明显抑制体外SMMC7721细胞的增殖,诱导细胞凋亡,导致Boyden小室穿膜的肿瘤细胞数明显下降。结论:干扰素-α可以直接抑制体外肝癌细胞SMMC7721的增殖和迁移并诱导细胞凋亡。

葡萄球菌肠毒素B对人肝癌和肺癌传代细胞株细胞增殖的影响

目的探讨葡萄球菌肠毒素B(SEB)对人肝癌传代细胞株SMMC7721和人肺癌传代细胞株D6细胞增殖的抑制作用。方法采用MTT比色法,检测不同浓度和作用时间的SEB对人肝癌传代细胞株SMMC7721和人肺癌传代细胞株D6增殖的抑制作用。结果应用不同浓度的SEB3d后,对SMMC7721细胞和D6细胞的增殖均产生抑制作用;5、10、20ng/ml的SEB均能抑制SMMC7721细胞和D6细胞的体外增殖,抑制的程度与SEB的浓度、作用时间有关。结论葡萄球菌肠毒素B对人肝癌传代细胞株SMMC7721和人肺癌传代细胞株D6能产生一定的增殖抑制作用。

联用维甲酸及氟脲嘧啶脱氧核苷治疗肝癌的实验研究

【目的】比较全反式维甲酸 (ATRA)和氟脲嘧啶脱氧核苷 (FUDR)单独作用或联合作用肝癌细胞的效应 ,为临床治疗肝癌的用药方案提供理论依据。【方法】以ATRA和FUDR分别及联合作用于培养的肝癌SMMC772 1细胞 ,以Hoechst33342 /PI双荧光活染技术、琼脂糖凝胶电泳 ,流式细胞光度术 (FCM )检测细胞凋亡。【结果】单独作用时 ,ATRA诱导的凋亡细胞数比FUDR组少 ,联用FUDR和ATRA时 ,引起的凋亡细胞数增加 ,染成红色的细胞数也增加 ,FCM检测结果与染色观察结果相符。【结论】多种方法检测结果表明 ,A TRA和FudR对肝癌SMMC772 1细胞的作用以诱导细胞凋亡的形式为主 ,可能是其抗癌的重要机制之一 ,且联合用药比单独用药的药效强 ,具协同增效作用 。

RN181过表达影响SMMC7721肝癌细胞凋亡的初步研究

目的构建过表达RN181基因的SMMC7721重组细胞株,研究RN181对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响,并初步探讨其凋亡机制。方法构建高表达RN181逆转录病毒感染SMMC7721细胞,显微镜观察其细胞株荧光强弱,Western blot鉴定RN181蛋白表达水平;采用DAPI染色法、Western blot检测RN181对顺铂诱导SMMC7721细胞株凋亡的变化情况。结果重组细胞株荧光表达良好,7721RN181细胞中RN181蛋白表达量高于其对照,差异有统计学意义(P<0.05)。DAPI染色法观察到在顺铂作用下,7721RN181的细胞凋亡阳性率高于其对照,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测到7721RN181的activated caspase-3、cleaved PARP的表达量高于对照组,procaspase-6,pro-caspase-8的表达量低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RN181表达能促进肝癌细胞的凋亡,其可能通过参与死亡受体凋亡途径来促进肝癌细胞凋亡。进而推测RN181基因可能成为肝癌靶向治疗的一个新靶点。

干扰RN181基因的表达抑制SMMC7721肝癌细胞的凋亡

[目的]探讨稳定干扰RN181基因对顺铂诱导的SMMC7721肝癌细胞凋亡的影响。[方法]采用RN181干扰慢病毒感染SMMC7721,流式分选出带绿色荧光的细胞,Western Blot鉴定RN181干扰情况;采用DAPI染色法、Western Blot检测RN181对顺铂诱导SMMC7721肝癌细胞凋亡的变化情况。[结果]重组细胞株荧光表达良好,7721KD中RN181蛋白表达量明显低于其对照组。DAPI染色法观察到在顺铂作用下,7721KD的细胞凋亡阳性率低于其对照组(P<0.05)。WB检测到7721KD activated caspase-3、cleaved PARP的表达量低于对照组,而pro-caspase-6、pro-caspase-8的表达量与对照组相比升高。[结论]稳定干扰RN181的表达能够抑制顺铂诱导的SMMC7721细胞凋亡,其机制可能是通过参与死亡受体凋亡途径。