电针通过HIF-1α和SOX-9维持兔膝骨关节炎软骨稳态及抗炎机制研究

目的观察电针对兔膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型软骨缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、性别决定区Y框蛋白9(SRY-box transcription factor 9,SOX-9)、基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、Ⅱ型胶原蛋白和炎症因子表达的影响,探讨电针干预改善KOA软骨稳态以及抗炎的可能作用机制。方法采用随机数字表法将实验兔分为对照组、模型组和电针组,每组10只。对模型组和电针组实验兔的右膝关节采用木瓜蛋白酶制造兔KOA模型。制模完成后,电针组给予电针犊鼻及内膝眼穴干预,每次30 min,每天1次,共14 d。模型组每天在固定器上固定15 min。对照组右膝关节注射等量0.9%氯化钠溶液。使用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)检测软骨组织的病理情况,原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)检测软骨细胞的凋亡情况,免疫组化检测软骨中Ⅱ型胶原蛋白的表达情况,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测软骨中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平,蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测HIF-1α、SOX-9、MMP-1和MMP-13的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测HIF-1α、SOX-9、MMP-1和MMP-13的mRNA水平。结果HE染色结果显示,与对照组相比,模型组软骨细胞数量明显减少,细胞核皱缩,基质染色呈浅色,潮线不完整,而电针组较模型组显著改善;改良Mankin's评分结果显示,模型组较对照组显著升高,电针组较模型组显著降低;TUNEL结果显示,电针组软骨细胞凋亡率显著低于模型组;免疫组化结果显示,与模型组相比,电针组的Ⅱ型胶原蛋白表达明显升高;ELISA结果显示与模型组相比,电针组的TNF-α、IL-1β表达明显降低;WB和qRT-PCR结果显示,与对照组相比,模型组的HIF-1α和SOX-9蛋白表达水平和mRNA水平显著降低(P<0.05),与模型组相比,电针组显著升高(P<0.05)。结论电针可能通过上调HIF-1α和SOX-9的表达,减少MMP-1、MMP-13、TNF-α、IL-1β的表达,增加Ⅱ型胶原蛋白的形成,从而发挥缓解软骨损伤、减少炎症反应的作用。

Lgr5及SOX-9在宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系

目的探讨含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体5(Lgr5)及性别决定区Y框蛋白9(SOX-9)在宫颈癌中的表达与临床意义。方法选取手术治疗的宫颈癌患者140例,同时选取同期因宫颈良性病变行肿物剥除或附件切除的40例患者作为对照组。应用免疫组化(S-P)方法检测140例宫颈癌组织(宫颈癌组)、140例宫颈癌癌旁组织(癌旁组)、正常宫颈组织40例(正常组)中的Lgr5及SOX-9蛋白表达,分析其与宫颈癌患者临床病理指标的关系。结果Lgr5及SOX-9在正常宫颈组织、癌旁组织和宫颈癌中的阳性率比较,差异具有统计学意义(P<0.05);Lgr5表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05),SOX-9表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。Lgr5与SOX-9呈正相关(r=15.27,P<0.05)。SOX-9蛋白和Lgr5蛋白(+++)表达者的5年生存率及中位生存时间均较(+^++)表达者低或短,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Lgr5及SOX-9的增强表达与宫颈癌侵袭性增强有密切关系,其表达可作为判断宫颈癌患者预后的指标。

SOX-9和转化生长因子-β1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的探讨应用SOX-9和TGF-β1基因转染大鼠ADSCs(Adipose stromal cells,ADSCs)后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路。方法6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150g。扩增、提取质粒pcDNA3.1-TGF-β1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代ADSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将SOX-9和TGF-β1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:对照组、转染空载体组、转染SOX-9组、转染TGF-β1组、SOX-9与TGF-β1共转染组。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Westernblot法检测筛选后细胞的表达。结果免疫荧光法检测ADSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD106呈阴性反应。MTT法测定各组细胞在490nm波长处的吸光度(A)值,未转染组、空载体组与SOX-9组、TGF-β1组、SOX-9与TGF-β1共转染组间差异显著(P<0.01)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;TGF-β1表达以SOX-9与TGF-β1共转染组组最多;II型胶原表达以SOX-9与TGF-β1共转染组最多。结论SOX-9和TGF-β1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

SOX-9在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨SOX-9在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化检测正常口腔黏膜、口腔上皮不典型增生及口腔鳞癌组织中SOX-9蛋白的表达情况,分析SOX-9蛋白与临床病理因素的相关性。结果:SOX-9在正常口腔黏膜组织、口腔上皮不典型增生及口腔鳞癌组织中的阳性表达率分别为10%(2/20)、32.1%(9/28)及79.4%(27/34),SOX-9在3种组织依次增加,在肿瘤发生发展过程中,SOX-9表达增加,各组表达差异有统计意义(P<0.001)。SOX-9表达和患者肿瘤体积、淋巴结转移、临床分期有关。单因素分析显示,肿瘤体积、淋巴结转移、临床分期、SOX-9阳性表达与存活时间有关(P<0.05); Cox多因素分析显示淋巴结转移、临床分期、SOX-9阳性表达是OSCC患者存活时间的独立因素(P<0.05)。结论:SOX-9在口腔鳞癌中异常高表达,SOX-9表达与口腔鳞癌患者存活率相关。

SOX-9转染骨髓基质细胞与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生物相容性

背景:Sox基因家族是一个新发现的基因家族,在胚胎发育、性别分化、神经系统及骨骼系统发育过程中起着重要的作用。目的:观察SOX-9基因转染骨髓基质干细胞后在聚乳酸-羟基乙酸共聚物培养生长的生物相容性,以及其复合材料修复软骨缺损动物模型的可行性。方法:将SOX-9基因转染成功后的骨髓基质细胞在聚乳酸-羟基乙酸共聚物培养生长,制备软骨缺损动物模型,将复合物植入软骨缺损,通过大体标本观察、组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学及RT-PCR检测对软骨缺损模型的修复效果。结果与结论:SOX-9基因转染骨髓基质干细胞后可以在聚乳酸-羟基乙酸共聚物上正常生长,并有Ⅱ型胶原的高表达,将复合物植入软骨缺损后,可以修复软骨缺损动物模型。聚乳酸-羟基乙酸共聚物与转染后的骨髓基质细胞具有良好的生物相容性,可以修复兔软骨缺损动物模型。

负载SOX-9的大鼠脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的SOX-9基因转染大鼠的ADSCs（Adipose stromal cells,ADSCs）,诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;SOX-9基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染SOX-9的ADSCs在目的基因SOX9、Aggrecan、CollagenⅡmRNA的表达和软骨特异性基质-CollagenⅡ的分泌上明显高于转染空载体组和对照组;结论SOX-9基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<001)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。

SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应。目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果。方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组。转染后第14天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的m RNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达。结果与结论:共转染组SOX-9 m RNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P<0.05);共转染组GDF-5m RNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P<0.05)。SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染。

SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡

背景:目前有研究表明,很多细胞生长因子可促进骨骺干细胞的增殖和分化,并且这种调控作用与Sox-9有密切的关系。目的:观察小分子干扰RNA沉默Sox-9基因及对大鼠骨骺干细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用酶消化法分离、免疫磁珠法纯化及免疫组织化学SABC法鉴定得到大鼠骨骺干细胞,首先进行预转染Sox-9 siRNA,判断转染效率,实验分2组:对照组常规培养,实验组采用Sox-9 siRNA转染。结果与结论:实验成功分离、纯化了原代骨骺干细胞,生长状态稳定、贴壁牢固,光学显微镜下细胞多呈梭形。免疫组织化学染色和免疫荧光鉴定显示,Sox-9 siRNA转染的大鼠骨骺干细胞可稳定表达相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3。RT-PCR,MTT,流式细胞仪检测检结果提示,与对照组相比,实验组Sox-9mRNA表达及细胞存活率降低(P<0.05),凋亡率增加(P<0.05)。结果证实,siRNA沉默Sox-9基因可调控大鼠骨骺干细胞的增殖和凋亡。

重组腺病毒介导SOX-9基因对颈椎关节突软骨细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导的人SOX-9(AdSOX-9)对人的颈椎关节突关节软骨细胞凋亡细胞数目及Caspase-3基因表达的作用及相关意义,更好理解颈椎软骨退变的发生机制。方法应用AdSOX-9按照不同浓度及作用时间处理体外培养软骨细胞,应用TdT介导dUTP-生物缺口末端标记方法(TUNEL)及免疫染色方法观察凋亡细胞数量及Caspase-3基因表达变化情况。结果25MOI、50MOI剂量作用组TUNEL阳性细胞较空白对照组均明显增加;AdSOX-9转染软骨细胞预处理后,空白对照组、25MOI作用组、50MOI三种处理组Caspase-3表达均明显增加,各时点较空白对照组比较,存在显著性差异(P<0.05)。结论SOX-9基因对软骨凋亡细胞数目、Caspase-3凋亡基因的影响,存在时间-剂量依赖关系,为软骨细胞退变发病机制研究提出新的思考。

Sox-9和igf-1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨应用Sox-9和igf-1基因转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)后,目的基因和蛋白分泌情况及向软骨细胞的分化效果。方法扩增、提取质粒pcDNA3.1-igf-1、pcDNA3.1-Sox-9,分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,将Sox-9和igf-1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染Sox-9组(C组)、转染igf-1组(D组)、Sox-9与igf-1共转染组(E组)。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,Sox-9表达以C组最多;igf-1表达以E组最多;II型胶原表达以E组最多。结论通过Sox-9和igf-1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向。

sox-9通过Wnt3a/β-catenin通路促进大鼠骨髓间充质干细胞分化

目的探讨sox-9对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖能力和分化能力的影响。方法分离并鉴定BMSCs,对细胞进行sox-9过表达和敲降处理。将细胞分为对照组、过表达对照组、干扰对照组、sox-9过表达组、sox-9干扰组。CCK8法检测细胞增殖活性;免疫组化观察细胞的Ⅱ型胶原蛋白(CollageⅡ)和聚蛋白聚糖(Aggrecan)表达水平;Western blot检测细胞sox-9、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。结果各组细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);sox-9过表达组的CollageⅡ和Aggrecan表达显著升高,而Wnt3a和β-catenin的表达显著降低(P<0.05)。结论sox-9可能是调控间质干细胞向软骨细胞分化能力的关键因子,通过抑制Wnt3a/β-catenin信号途径,促进其向软骨细胞分化。

调控脂肪间充质干细胞成软骨分化基因Sox-9和低氧诱导因子1α的表达

背景:有学者采用基因转染的方法诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化,使种子细胞能够稳定合成和分泌特定的细胞因子,从而达到长期稳定刺激种子细胞增殖、分化和软骨形成的目的。目的:观察胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞低氧诱导因子1α和Sox-9表达的影响。方法:(1)取成年新西兰大耳白兔颈后部皮下脂肪组织,分离、培养兔脂肪间充质干细胞,免疫荧光法鉴定后在脂质体介导下应用pc DNA3.1-IGF-1基因转染脂肪间充质干细胞,G418筛选,获得稳定转染的细胞株;(2)实验分为3组:正常传代培养的脂肪间充质干细胞;转染pc DNA3.1的脂肪间充质干细胞;转染pc DNA3.1-IGF-1的脂肪间充质干细胞。(3)RT-PCR及Western blot法检测转染后细胞中胰岛素样生长因子1的表达,MTT法绘制细胞增殖曲线,Dil荧光染料标记后计数细胞增殖效率,免疫荧光法分析转染后细胞低氧诱导因子1α和Sox-9的表达情况,DMMB定量测定总糖胺聚糖含量。结果与结论:(1)成功构建稳定表达pcD NA3.1-IGF-1的细胞株,RT-PCR及Western blot检测证实转染后的细胞株在m RNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达,并且成功翻译为蛋白;(2)MTT提示转染后细胞增殖活性增强;(3)胰岛素样生长因子1基因转染显著提高Dil标记脂肪间充质干细胞的增殖效率;(4)转染后细胞的低氧诱导因子1α和Sox-9表达阳性;(5)胰岛素样生长因子1基因转染组糖胺聚糖含量明显高于其他2组(P<0.01)。(6)结果说明,胰岛素样生长因子1基因转染能够能够有效促进脂肪间充质干细胞增殖,促使阳性表达低氧诱导因子1α和成软骨分化调控基因Sox-9,并有效促进细胞分泌软骨细胞外基质糖胺聚糖。

SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞

目的探讨SOX(sry-type high-mobility-group box)-9基因转染兔骨髓基质细胞的方法及可行性。方法构建SOX-9基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染兔骨髓基质细胞,通过形态学观察、免疫组织化学、酶联免疫吸附法及反转录-聚合酶链反应检测SOX-9基因转染兔骨髓基质细胞的成功性,以及转染后骨髓基质干细胞的生物学特性。结果免疫组织化学检测实验组细胞内有稳定的SOX-9表达,在2周的表达量高于6d的表达量。RT-PCR结果表明只有实验组有SOX-9的基因表达。酶联免疫吸附法检测结果显示各时间点SOX-9的基因表达实验组均明显高于其余2组(P<0.01),实验组表达量48h时达到最高。结论SOX-9基因可以转染兔骨髓基质干细胞,并能诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化。

SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞的可行性(英文)

背景:SOX-9在软骨组织的发生和发育中具有重要作用,可促进间充质细胞凝集,具有转录激活结构域,能直接调控转录。目的:选用SOX-9基因构建pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,观察SOX-9基因对骨髓基质细胞生长特性及产物表达的影响。设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。材料:SPF级6周龄新西兰大白兔8只,用于分离培养骨髓基质细胞。方法:采用脂质体介导法将构建的pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,细胞转染分为SOX-9质粒转染组、空质粒组、只加入等量脂质体的空白对照组。主要观察指标:通过细胞形态、细胞生长活性、免疫组织化学及HE染色、RT-PCR法、ELISA法检测SOX-9基因转染骨髓基质细胞是否成功。结果:pDC316-SOX-9质粒转染4d出现小片的细胞集落,挑取克隆扩增培养后,细胞呈梭形纤维状。随转染时间的延长,空白对照组细胞逐渐死亡,SOX-9质粒转染组、空质粒组的细胞活性均显著延长,在转染2周达高峰,之后逐渐降低。转染第6天,SOX-9质粒转染组骨髓基质细胞免疫组织化学染色呈棕黄色,稳定表达SOX-9蛋白,HE染色可见多个双核细胞,细胞增殖旺盛,与成软骨细胞类似;空质粒组无SOX-9蛋白表达,组胞增殖分裂不旺盛。SOX-9质粒转染组表达SOX-9 mRNA,空质粒组及空白对照组均无SOX-9 mRNA表达。转染后24,48,72h及1,2周,SOX-9质粒转染组细胞上清液中SOX-9含量均明显高于空质粒组、空白对照组(P<0.01)。结论:利用pDC316-SOX-9质粒成功转染兔骨髓基质细胞,增强细胞生长活性,并能持续稳定的分泌SOX-9蛋白,可诱导骨髓基质细胞向软骨方向分化。

SRY基因、SOX-9基因检测在性反转中的应用研究

目的探讨在性反转综合征患者中SRY基因和SOX-9基因是否存在和突变对性腺发育的影响。方法分析了5例性反转患者,其中46,XX男性性反转4例,1例46,XY女性性反转的染色体核型,并对SRY基因存在与否用原位杂交(FISH)进行了检测。结果 3例46,XX男性性反转SRY基因阳性,1例46,XY.t(10;13)(p10;q22)女性性反转SRY基因阴性,1例46,XX男性性反转患者SRY基因阴性。5例均检测到SOX-9基因,并对这1例SRY基因阴性而SOX-9基因阳性的患者进行了基因测序,未发现SOX-9基因存在基因的突变。结论 SRY基因在性别分化中的重要基因,SOX-9基因的重复拷贝对性别的分化也十分重要。

大鼠肌腱干细胞的分离培养鉴定及拉力对其Sox-9表达的影响

目的分离培养大鼠肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)并检测其干细胞特性,观察拉力对大鼠TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响。方法取SPF级12周龄SD大鼠两侧髌腱,胶原酶消化,以低密度接种分离出TSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,结晶紫染色观察克隆形态和数量,流式细胞术检测其MSCs表面标记进行鉴定。体外力学加载仪对第3代TSCs施加4%、0.17 Hz的拉力作为实验组,对照组TSCs未进行拉力加载,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测拉力对TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响。结果倒置相差显微镜观察示,分离出的原代细胞主要呈星状,第1代细胞呈纤维细胞状。分离出的细胞7 d后形成单细胞克隆;流式细胞仪检测示其CD29、CD44、CD90表达阳性,CD45表达阴性。荧光定量PCR和Western blot法检测示,与对照组相比,实验组拉力加载后4 h Sox-9基因水平下调、蛋白表达明显降低,24 h Sox-9基因水平上调、蛋白表达明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论成功分离大鼠TSCs且符合MSCs特性;拉力刺激初始抑制了Sox-9表达,但拉力刺激完全消失后Sox-9表达上升。

荷载RADA-16/Sox-9的骨髓间充质干细胞在兔退变椎间盘修复中的作用

目的探讨荷载RADA-16/Sox-9的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对兔退变椎间盘的修复作用及可能机制。方法40只大白兔随机分为对照组、Sox-9MSCs组、RADA-16MSCs组、RADA-16+Sox-9 MSCs组各10只,4组均采用自行设计的加压装置制备退变椎间盘模型。对照组不作处理,Sox-9 MSCs组、RADA-16 MSCs组、RADA-16+Sox-9MSCs组在造模成功后7d分别向L_(3/4)、L_(4/5)、L_(5/6)椎间隙注射Sox-9转染MSCs、RADA-16转染MSCs、RADA-16+Sox-9转染MSCs溶液各5mL。分别于转染前、转染后3个月行腰椎X线片、MRI检查测量髓核矢状径指数、根袖直径、神经根鞘袖和硬脊膜夹角、病变间隙、临近节段椎间隙高度变化;于转染前、转染后3个月分别处死5只兔,取椎间盘制作病理切片,采用免疫组织化学法检测髓核组织中Ⅱ型胶原表达。结果4组转染前髓核矢状径指数、根袖直径、神经根鞘袖和硬脊膜囊夹角比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后3个月,对照组、RADA-16 MSCs组、Sox-9MSCs组、RADA-16+Sox-9MSCs组髓核矢状径指数(0.36±0.13、0.33±0.12、0.20±0.14、0.17±0.11)、神经根鞘袖和硬脊膜夹角[(26.92±1.10)°、(26.23±1.17)°、(25.77±1.17)°、(25.32±1.18)°]依次降低,根袖直径[(0.21±0.05)、(0.29±0.04)、(0.37±0.06)、(0.45±0.05)cm]依次增加(P<0.05);4组转染前病变间隙、临近节段椎间隙高度变化、Ⅱ型胶原表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);转染后3个月,对照组、RADA-16 MSCs组、Sox-9 MSCs组、RADA-16+Sox-9MSCs组病变间隙[(26.89±1.11)、(24.77±1.13)、(21.28±1.12)、(16.33±1.13)cm]、临近节段椎间隙高度变化[(1.68±0.12)、(1.50±0.10)、(1.29±0.11)、(1.01±0.10)mm]依次降低,Ⅱ型胶原表达(190.65±1.35、208.80±1.40、221.34±1.56、240.95±1.45)依次增加(P<0.05)。结论荷载RADA-16/Sox-9的MSCs对兔退变椎间盘有较好的修复作用,可能与其能增加髓核组织中Ⅱ型胶原含量有关。

慢病毒介导的Sox-9基因转染对大鼠关节软骨细胞炎性反应的影响

目的评价Sox-9基因过表达对IL-β诱导的大鼠关节软骨细胞(RCs)炎性反应的影响,为临床提供参考依据。方法通过慢病毒(Lv-Sox-9)感染的方法在RCs细胞中过表达Sox-9,RT-PCR,Western blot检测病毒感染后大鼠软骨细胞中Sox-9、CollagenⅡ基因mRNA及蛋白含量;将细胞分为3组,细胞对照组,IL-1β诱导组,对照病毒感染且IL-1β诱导组和Sox-9过表达且IL-1β诱导组,将软骨细胞或者病毒感染后的软骨细胞接种于纳米孔氧化铝膜上,正常条件培养24h后,诱导组细胞培养液中添加5μg/L的IL-1β,继续培养3d,CCK-8法检测细胞增殖活性变化、扫描电镜观察细胞形态及代谢变化。结果通过慢病毒感染的方法可以在大鼠关节软骨细胞中有效上调Sox-9基因的表达,病毒感染后72h,Lv-Sox-9感染组细胞内Sox-9mRNA和蛋白含量均显著高于细胞对照组和对照病毒组;检测结果还显示,Rcs细胞内CollagenⅡ基因在转录和蛋白表达水平均与Sox-9正相关。结论 Sox-9可以作为抗炎治疗的潜在目标基因。

黄鳝Sox9基因的克隆及其鉴定分析

Ｓｏｘ９基因在人和多种动物中具有进化保守性，在性别决定过程中发挥着重要作用。通过对黄鳝Ｓｏｘ９基因的分子克隆及其限制酶切分析，确定了该克隆的限制酶图谱。从限制酶片段的ＰＣＲ分析以及ＨＭＧ盒的ＤＮＡ序列测定，鉴定该阳性克隆为黄鳝Ｓｏｘ９基因克隆。黄鳝Ｓｏｘ９基因的克隆进一步说明Ｓｏｘ９基因在进化上的高度保守性。对其基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ序列结构和转基因黄鳝的深入研究，无疑有助于从进化上阐明Ｓｏｘ９基因功能。