实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70及MTA1的表达及意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中SP70抗原及肿瘤转移相关基因(MTA1)的表达及意义。方法采用实时荧光定量PCR相对标准曲线法检测40例NSCLC组织和20例良性病变肺组织中SP70及MTA1的表达水平,定量分析其与临床及病理学特征的关系,比较二者的应用价值。结果 NSCLC组SP70及MTA1平均表达水平均明显高于肺良性病变组(1.768±0.275、1.546±0.382vs 0.921±0.238)pmol/μL(P<0.05),其中SP70与MTA1的表达呈正相关(r=0.458,P<0.05),SP70平均表达水平高于MTA1(1.768±0.275)vs(1.546±0.382)pmol/μL(P<0.05);SP70及MTA1的表达水平与肺癌的临床分期及淋巴结转移情况有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。结论 SP70及MTA1均是评价NSCLC的潜在指标,SP70可能优于MTA1。

趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤

背景:在外加变化磁场作用下,磁小体可侵入肿瘤细胞,抑制其增殖。目的:研究趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物治疗骨肉瘤的效果。方法:将人源骨肉瘤细胞株U2OS分4组培养,A组加入趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统;B组加入趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统;C组加入趋磁细菌磁小体载pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物系统,同时给予磁场干预;D组加入趋磁细菌磁小体载pHSP-shNC/阿霉素复合物系统,同时给予磁场干预;pHSP-shNC为pHSP70-shPLK1的空白对照。培养12,24,48,72h,观察骨肉瘤细胞对复合物的摄取率,流式细胞术观察细胞周期,RT-PCR法和Westernblot法检测细胞中PLK1mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞增殖,黏附实验和Transwell小室检测细胞黏附性和侵袭能力,凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。结果与结论:(1)培养12,24h,D组摄取率最高;培养48,72h,B组摄取率最高;(2)A组、C组和D组G_2/M期比率逐渐降低,G_0/G_1期比率逐渐增加,C组G_2/M期比率各时间点最低,其次为D组,A组最高;B组G_2/M期比率逐渐增加;(3)培养12,24h,B组、D组PLK1表达高于A组、C组(P<0.05);培养48,72h,B组PLK1表达高于其余3组(P<0.05),D组高于A组、C组(P<0.05);(4)B组不同时间点的细胞增殖、黏附率及侵袭能力最高,细胞凋亡率最低;C组不同时间点的细胞增殖、黏附率及侵袭能力最低,细胞凋亡率最高;(5)结果表明,趋磁细菌磁小体靶向输送pHSP70-shPLK1/阿霉素复合物能够增强骨肉瘤细胞凋亡的发生,抑制其增殖和侵袭。

实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70的表达及意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中SP70抗原的表达及意义。方法选取40例肺癌组织作为肺癌组[NSCLC 32例(NSCLC组),小细胞肺癌8例(小细胞肺癌组)],另取20例良性病变肺组织作为肺良性病变组,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)相对标准曲线法检测各组中SP70抗原表达的相对水平,定量分析其与临床组织病理学特征的关系。结果肺癌组SP70平均表达水平为(1.798±1.275)pmol/μl,明显高于肺良性病变组的(0.921±0.238)pmol/μl,差异有统计学意义(P<0.05);NSCLC组SP70平均表达水平为(2.334±1.268)pmol/μl,高于小细胞肺癌组的(1.171±1.286)pmol/μl,差异有统计学意义(P<0.05);SP70表达水平与患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度均无关(P>0.05)。结论 SP70可能是评价NSCLC的一个潜在的指标。

CD146、SP70在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义

目的:探讨CD146、SP70在卵巢上皮性癌组织中的表达及意义。方法:收集100例卵巢上皮性癌组织标本,50例卵巢上皮良性肿瘤组织标本和同期由于其他手术治疗切除的50例正常卵巢组织标本。免疫组化法检测中标本组织中CD146、SP70的表达;并分析卵巢上皮性癌组织中CD146、SP70的表达与年龄、瘤体大小、淋巴结转移、病理分型、病理分级及FIGO分期的关系。结果:CD146及SP70在正常卵巢组织中的阳性表达(4.0%、8.0%)和卵巢上皮良性肿瘤的阳性表达(18.0%,26.0%)低于卵巢上皮癌组织中的阳性表达(82.0%、77.0%),经比较,差异具有统计学意义(P<0.05);CD146和SP70在年龄、瘤体大小、淋巴结转移与否方面的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05);在不同的病理类型中,CD146的表达差异无统计学意义而SP70的阳性表达差异具有统计学意义(P<0.05);分化水平越高和FIGO分期越低,CD146和SP70阳性表达率越低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD146和SP70的表达与卵巢癌的进展存在密切联系,对CD146和SP70的联合检测可用于判断卵巢上皮癌的恶性度及其预后。

细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和初步鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,EG)2热休克蛋白70(heat shock protein,2HSP70)表达重组质粒,原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法从EG2HSP70/pGEM-T/JM109质粒中分离EG2HSP70目的基因,将此片段重组入表达载体pGEX-6P-1后转化入大肠杆菌BL21,鉴定后以IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE检测其表达水平,用亲和层析纯化并分离重组蛋白,利用Western blot来鉴定重组蛋白的免疫学特性。结果酶切鉴定及测序分析表明,成功构建细粒棘球蚴pGEX-6P-1/EG2HSP70重组质粒;IPTG诱导表达后,融合蛋白占菌体总蛋白的39%,占裂解物上清总蛋白的70.4%,表明重组的EG2HSP70基因能在BL21中高效表达,表达的蛋白大部分以可溶性状态存在。亲和层析法纯化重组蛋白EG2HSP70,通过Western blot证实该重组蛋白能被细粒棘球蚴囊壁免疫兔血清识别。结论成功构建细粒棘球蚴中国大陆株pGEX-6P-1/EG2HSP70重组质粒,重组的EG2HSP70能够高效表达,表达的EG2HSP70具有免疫学活性。

人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制

目的构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,筛选具有中和活性的人源单克隆抗体,为EV71感染引起的手足口病临床诊断及治疗奠定基础。方法从成人志愿者抗凝血中分离外周淋巴细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA。以cDNA为模板,用人源IgG Fab段基因引物扩增轻链及重链Fd区基因,分步克隆至pComb3载体,构建Fab噬菌体抗体库。以SP70为抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,将获得的重组噬菌体感染XL1-Blue菌并诱导表达,用SP70对诱导表达的菌上清进行筛选。结果共获得3株轻、重链基因组合序列不同的克隆,且这3株Fab抗体可特异性结合SP70多肽。结论成功构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,并从中筛选出3株针对EV71病毒结构蛋白VP1上中和线性表位SP70的特异性人源Fab抗体,为研发新的手足口病诊断和治疗工具奠定基础。

液基细胞学、肿瘤标志物SP70联合检测对肺腺癌转移胸腔积液的诊断价值

目的:探讨液基细胞学与肿瘤标志物SP70联合检测对肺腺癌转移胸腔积液的诊断价值。方法:回顾性分析徐州医科大学附属医院2018年11月至2019年3月收治肺腺癌转移胸腔积液27例和非癌性胸腔积液12例,收集放化疗前患者的胸腔积液,采用美国SurePathTM PrepStain全自动液基薄层细胞制片染片机(BD TriPath)及相关耗材制备液基薄片,巴氏染色用于细胞学诊断,同时采用双抗体夹心ELISA法对39份胸腔积液标本上清进行SP70检测。统计分析液基细胞学联合SP70检测对恶性胸腔积液诊断的敏感性、特异性、符合率。结果:以27份癌性胸腔积液和12份非癌性胸腔积液SP70的ELISA检测结果作ROC曲线,分析得出胸腔积液SP70>9.73 ng/mL,可以帮助预测肺腺癌转移胸腔积液,AUC为0.824,采用该截断值诊断肺腺癌转移胸腔积液的敏感性、特异性分别为70.4%和91.7%。液基细胞学与肿瘤标志物SP70联合检测的符合率为89.7%,灵敏度为81.4%,均高于单独液基细胞学的检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:液基细胞学联合肿瘤标志物SP70有助于提高肺腺癌转移胸腔积液的诊断。

SP70抗原在癌性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值

目的探讨SP70抗原检测在癌性胸腔积液鉴别诊断中的应用价值。方法选取2013年1月至2014年1月达州陆军医院收治的200例胸腔积液患者作为研究对象、其中100例癌性胸腔积液,100例非癌性胸腔积液。患者的胸腔积液均检测SP70抗原、癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及细胞角质蛋白19片段(Cyfra21-1),并以病理检测结果为金标准,评价其在癌性胸腔积液鉴别诊断中的诊断效能。结果 SP70在诊断癌性胸腔积液时的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值分别为70.0%、88.0%、79.0%、85.4%、74.6%。鳞癌、腺癌SP70抗原阳性检出率分别为76.5%和83.0%,均高于小细胞癌的26.3%,差异有统计学意义(χ2=12.628,19.549,均P<0.05)。结论与传统的肿瘤标志物相比,SP70抗原在癌性胸腔积液鉴别诊断中具有更高的诊断效能,检测方法简单、无创,有较高的临床应用价值。

SP70检测在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床应用价值

目的探讨SP70检测在良恶性胸腔积液鉴别中的临床应用价值。方法选取2011年4月至2011年12月在我院就诊并经临床明确诊断为良性胸腔积液和恶性胸腔积液患者各90例,采集患者胸腔积液标本,检测SP70、CEA、Cyfra21-1和NSE水平,并进行比较分析。结果恶性胸腔积液组患者SP70、CEA、CYFRA21-1检测阳性率分别为72.2%、58.9%和53.3%,显著高于良性胸腔积液组的10.0%、13.3%和22.2%(P<0.05);恶性胸腔积液组NSE阳性率(31.1%)与良性胸腔积液组(20.0%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。恶性胸腔积液组SP70敏感度、特异度和符合率分别为72.2%、89.2%和81.6%,CEA敏感度、特异度和符合率分别为58.9%、84.9%和74.2%,Cyfra21-1敏感度、特异度和符合率分别为53.3%、67.1%和58.4%,NSE敏感度、特异度和符合率分别为31.1%、78.0%和50.2%。两组患者血清SP70检测率分别为5.6%、6.7%,差异无统计学意义(P>0.05),而胸腔积液SP70检测率分别为10.0%、72.2%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 SP70对良、恶性胸腔积液的鉴别诊断具有着重要的临床价值和潜在的辅助作用,可为相关疾病的早期诊断和治疗提供有效信息。

肿瘤标志物SP70在宣威肺癌中的临床应用研究

目的肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,在中国,云南省宣威地区人群以肺癌高发、恶性程度高、预后极差等特点引起了广泛的关注和研究。在对于宣威肺癌的研究中,一直缺乏特异性高、与病情变化相关性高、检测方法简便快速的肿瘤标志物。肿瘤特异性蛋白70(tumor specific protein 70,SP70)是单克隆抗体NJ001识别的特异性抗原,在非小细胞肺癌组织上的表达率为80%~90%,在肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭转移中发挥着极其重要的作用。探索肿瘤标志物SP70与宣威肺癌相关性,有助于此类癌症的早期诊断、动态监测以辅助判断病情进展或治疗效果。因此本文就肿瘤标志物SP70在宣威肺癌诊断中的应用现状,对其特点进行分析,从宣威肺癌的疾病背景、肿瘤标志物SP70与宣威肺癌的相关性及检测方法等方面出发,探究肿瘤标志物SP70在宣威肺癌诊断和治疗中的应用,以期为宣威肺癌的早期诊断和预后判断提供新的思路。

SP70在乳腺肿瘤患者血清中的检测及其临床意义

目的初步探讨新型肿瘤标志物SP70在乳腺良恶性肿瘤患者血清中检测的临床意义。方法运用双抗体酶联免疫吸附法检测42例乳腺癌患者(乳腺癌组)、16例乳腺良性肿瘤患者(乳腺良性肿瘤组)和14名正常女性体检患者(健康体检组)血清中SP70的含量。结果乳腺癌、乳腺良性肿瘤患者血清中SP70的含量高于健康体检女性,差异具有显著统计学意义(P<0.05);乳腺良性肿瘤患者和乳腺癌血清中SP70的浓度差异无统计学意义(P>0.05)。结论新型肿瘤标志物SP70在乳腺良恶性肿瘤患者血清中的含量高于健康对照组,具有一定的临床意义,但无法鉴别诊断乳腺肿瘤的良、恶性。

肠道病毒71型中和表位肽SP55、SP70及VP2-28在人血清中的抗体滴度特征研究

目的:通过肠道病毒71型(EV71)阳性患者抗血清对动物模型的中和表位肽SP55、SP70及VP2-28进行评价,研究动物中确定的表位肽与人抗血清的反应特征。方法:采用体外微量中和实验的方法,筛选高中和抗体滴度的患儿血清共13个样本,其中2 048倍样本8个,4 096倍样本4个,8 192倍样本1个。使用MEGA5. 0软件对目标中和表位肽SP55、SP70和VP2-28进行序列比对,确定最终使用序列。ELISA分析3个中和表位肽分别在N端和C端偶联BSA的情况下,其在抗血清中的抗体滴度。结果:EV71的中和抗体水平会随着EV71总抗体水平的升高而升高。SP55肽无论在N端还是C端偶联牛血清白蛋白BSA都具体较高的抗体滴度,但SP55肽C端偶联BSA的抗体滴度随着抗血清的中和滴度的升高而升高。VP2-28肽N端偶联BSA的抗体滴度普遍高于C端偶联。SP70肽在人抗血清中的抗体滴度普遍不高,其中N端偶联的SP70肽好于C端偶联。结论:SP55肽和VP2-28肽在人抗血清中具有较高的抗体滴度,而不同方向的偶联对于中和表位肽具有很大影响。

铜锈环棱螺HSP70对Cd和BDE-47胁迫的响应敏感性

采用沉积物生物毒性测试,分别研究了不同含量Cd和BDE-47污染沉积物对铜锈环棱螺（Bellamya aeruginosa）肝胰脏热休克蛋白HSP70表达水平的变化,以揭示Cd和BDE-47胁迫与HSP70表达响应的时间/剂量-效应关系,探讨HSP70作为持久性有毒物质对铜锈环棱螺早期伤害生物标志物的敏感性。结果表明,受到不同含量Cd和BDE-47加标沉积物胁迫后,铜锈环棱螺肝胰脏HSP70表达均表现出较为明显的时间/剂量-效应关系。在Cd短期（0~10 d）暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高而显著升高（p〈0.05）;在Cd长期（10~21 d）暴露下,HSP70应激水平随Cd含量的升高表现为先升后降,低Cd含量（5μg·g^-1）暴露下HSP70应激水平随暴露时间的延长而显著上升（p〈0.05）;中、高Cd含量（25、100μg·g^-1）暴露下HSP70应激水平随时间的延长均呈先升后降的趋势。不同含量BDE-47暴露下HSP70应激水平时间的延长大体上均呈先升高后降低的变化趋势;低、中含量BDE-47（160、640 ng·g^-1）短期暴露对HSP70应激水平没有影响,而长期（10~21 d）暴露后,HSP70应激水平均显著降低（p〈0.05）。比较而言,HSP70对Cd低含量（5μg·g^-1）短期（低于10 d）暴露显示出较好的敏感性,而对BDE-47低含量（160 ng·g^-1）短期暴露表现不敏感;低含量Cd和BDE-47长时间（10~21 d）暴露下,HSP70均具有较好的指示作用。

秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制

为探究秦川牛宰后热休克蛋白A6(heat shock protein A6,HSPA6)差异表达对肉品质的影响,以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为研究对象,测定贮藏0、2、4、6、8 d时肉品质变化情况;基于4D-非标记定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)蛋白质组学分析宰后秦川牛背最长肌中HSP70家族成员HSPA6及相关差异蛋白表达情况。结果表明:随贮藏时间延长,HSPA6表达量呈下降趋势,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide,NADH)含量均呈下降趋势,肌纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)呈上升趋势,剪切力、离心损失率均呈先上升后下降趋势;由相关性分析结果可知,HSPA6表达量与ATP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关(P<0.05),与MFI、离心损失率呈极显著负相关(P<0.01),表明在贮藏过程中HSPA6降解与牛肉能量代谢及保水性有密切联系。蛋白质组学分析发现贮藏过程中表达量变化显著的差异蛋白中有24种与HSPA6表达相关,通过碳水化合物衍生物结合、嘌呤核苷三磷酸结合等途径引起蛋白酶体介导泛素依赖性蛋白质分解代谢、细胞蛋白分解等,造成代谢紊乱或者代谢失衡,同时还能够控制蛋白质降解、细胞凋亡等变化,进而影响肌肉结构变化,降低组织能量水平,并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。

抗应激中药冲剂对猪肝脏热应激蛋白70表达的影响

研究抗应激中药冲剂对高温应激下猪肝脏组织热应激蛋白70(Hsp70)表达的调控效果。选取64头3月龄中国实验用小型猪,随机分为常温对照组、高温应激组、方Ⅰ、Ⅱ组,于高温第1,3,6,10天动态取样后,分别采用免疫组织化学和ELISA法测定肝中Hsp70的蛋白表达定位定量变化。结果表明,高温应激后,猪肝脏组织细胞阳性率显著增加(P<0.05),方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏细胞阳性率显著高于常温组(P<0.05)但低于高温组(P<0.05);ELISA方法结果显示高温组、方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏组织Hsp70含量显著增加(P<0.05),方Ⅱ组Hsp70含量在第3,6天比高温组显著增加(P<0.05)。因此,中药抗应激冲剂可通过增加肝脏Hsp70蛋白含量水平来提高机体细胞热耐受,达到保护作用,且方Ⅱ组效果优于方Ⅰ组。

人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究

目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物。方法以人HSP0 cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌BL21上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化。结果应用PCR方法扩增出约1900bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70kD处有蛋白表达,Western blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上。结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件。

脑淋巴引流阻滞加重蛛网膜下腔出血后脑脊液所致海马神经元凋亡

本文旨在探讨脑淋巴引流系统在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后神经元损伤中的作用。分别建立兔SAH、SAH+脑淋巴引流阻滞(cerebral lymphatic blockage,CLB)模型,于SAH模型建立后5d抽取脑脊液,加入培养的大鼠海马神经元中,随机将神经元分为空白对照组、正常脑脊液组、SAH组、SAH+CLB组,分别于培养0.5h、1h、2h、4h后,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率,流式细胞术检测神经元凋亡,免疫组织化学法检测细胞凋亡蛋白Bax、Hsp70的表达。结果显示:正常脑脊液对神经元LDH漏出率无影响,SAH组和SAH+CLB组脑脊液使神经元LDH漏出率增加,以SAH+CLB组更为显著;正常脑脊液没有引起神经元凋亡,SAH组出现神经元凋亡,SAH+CLB组神经元凋亡更为严重。在SAH组和SAH+CLB组均检测到Bax及Hsp70蛋白表达;Bax蛋白表达在SAH+CLB组大于SAH组,且呈时间依赖性增强;在0.5h和1h,SAH+CLB组Hsp70蛋白表达高于SAH组,而在2h和4h则表达减弱,SAH+CLB组表达高峰(1h)早于SAH组(2h)。以上结果表明,CLB加重SAH脑脊液对神经元的损伤,提示脑淋巴引流系统在SAH后可能起到一定的内源性保护作用。

EV71中和表位嵌合病毒样颗粒的表达纯化

目的通过原核系统表达纯化嵌合肠道病毒71型（EV71）中和表位SP70的病毒样颗粒（VLPs），作为备选的EV71基因重组亚单位疫苗。方法将SP70插入乙肝病毒核心抗原（HBeAg）截短序列的主要免疫显性区域，合成融合蛋白基因后连接表达质粒转化人大肠埃希菌诱导表达，经DEAE离子交换层析、CsC1垫层离心以及密度梯度离心后得到纯化的重组VLPs，并通过WesternBlot和ELISA实验鉴定其抗原性。结果成功构建重组质粒pHBc-SP70，在大肠埃希菌中经IPTG低温诱导后高效表达，可溶性目的蛋白经离子交换层析、CsCl垫层离心和密度梯度离心三步纯化后纯度可达90％以上；纯化的融合蛋白可自发折叠组装为病毒样空心颗粒，与抗SP70单克隆抗体和抗HBe单克隆抗体均可特异性结合。结论在原核系统中成功高效表达和纯化了表面展示EV71中和表位的嵌合HBe-SP70VLPs，并证实其具有良好的抗原性，为该EV71基因重组疫苗的免疫效果评价奠定了基础。