自噬受体蛋白p62的表达及功能研究

目的:构建人自噬受体蛋白p62的真核表达质粒,初步探索p62在氧化应激中的功能。方法:从HeLa细胞系中扩增SQSTM1基因,插入真核表达载体nFLAG/pRK5,构建p62的重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5。采用HEK293T细胞表达带有FLAG标签的重组p62蛋白,免疫共沉淀法观察p62和核因子E2相关因子2(Nrf2)相互作用。结果:重组表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5经琼脂糖凝胶电泳和测序对比均与预期结果一致,Western blot实验中p62蛋白可正常表达,且大小与预期结果一致。免疫共沉淀和蛋白质谱证明p62与氧化应激转录调控蛋白Nrf2可相互作用。结论:采用真核表达系统成功表达p62蛋白,并发现其与Nrf2可相互作用,为进一步研究p62与Keap1-Nrf2通路关系提供依据。

影响肝癌预后独立危险因子的信息学分析

目的:通过生物信息学调研和分析,探讨对肝癌预后产生影响的独立危险因子及其与肝癌靶向药索拉非尼作用靶点的相互关联特征。方法:从TCGA数据库收集的248例肝癌患者中选取79例死亡患者的基因表达量、生存时间、生存状态数据,以中位生存时间360 d为界将这些死亡患者分为2组,用DEseq算法对这2组患者的基因表达量数据进行差异基因筛选。不考虑其他混杂因素,仅考虑差异基因表达单个因素与患者生存时间相关,用Kaplan-Meier法对差异基因进行单因素分析。将分析得到的差异基因表达量和患者生存时间、生存状态整合的矩阵用COX回归模型作生存分析,寻找对肝癌预后产生影响的独立危险因子。以STRING数据库为基础,将得到的差异基因与肝癌靶向药索拉非尼的作用靶点结合构建蛋白互联网络,探寻索拉菲尼作用靶点与差异基因的关系。结果:DEseq算法初筛得到52个有可能对肝癌预后产生影响的差异基因。Kaplan-Meier法分析得到26个与患者生存时间相关的差异基因。COX分析最终确认3个差异基因(SQSTM1、ANXA10和STMN1)为影响肝癌预后的独立危险因子。其中ANXA10为负向影响因素,而STMN1与SQSTM1为肝癌患者预后的正向影响因素。蛋白质相互作用网络显示,肝癌靶向药索拉非尼的作用靶点与多个差异基因密切相关。ANXA10参与钙离子结合和钙依赖性磷脂结合,STMN1和SQSTM1在多种信号通路中起重要作用。结论:ANXA10、STMN1和SQSTM1可能是对肝癌预后产生影响的独立危险因子,可作为未来开发靶向药物的作用靶点或患者预后预测指标。

一个Paget骨病家系SQSTM1及TNFRSF11A基因突变分析

目的研究一Paget骨病家系SQSTM1基因及TNFRSF11A基因突变情况。方法收集一Paget骨病家系,家系成员外周血中提取基因组DNA,应用聚合酶链式反应、直接测序对该家系成员SQSTM1及TNFRSF11A基因外显子进行测序。测序结果与GenBank公布的SQSTM1和TNFRSF11A基因正常序列对比,寻找有无突变。结果在该家系中未发现与Paget骨病共分离的致病基因突变,检测到14个已知的单核苷酸多态性。结论该家系成员的发病情况与SQSTM1、TNFRSF11A基因中发现的SNP无相关性,排除其为该Paget骨病家系致病基因的可能性。