抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定性PCR检测方法的建立及其标准化

抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已经批准获得我国进口用作加工原料的安全证书,含有外源HaHB4基因和bar标记基因。本研究根据抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端和3′端插入位点旁侧序列信息,设计19对引物,结合罗萨里奥农业生物技术学院公司的1对引物,针对20对引物组合利用定性PCR技术进行引物特异性筛选,结果显示5′端的14号引物特异性良好,优化后获得最佳反应体系和反应程序;经测试,该引物特异性好、稳定性高,检出限达0.1%,扩增片段大小248 bp。经8家有资质实验室对本方法的特异性、检出限、重复性和再现性进行验证,各项参数均达到国家标准要求。本研究成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体定性PCR检测方法,为IND-ØØ41Ø-5转化体在国内的安全监管提供技术支撑。

羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。

辣椒SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记(Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)是由Li和Quiros发展了一种新的分子标记技术。SRAP标记具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点,已经应用于在水稻、棉花、油菜、马铃薯、苹果、柑橘类果树、樱桃、梅子、大蒜、莴苣及芹菜等植物和水稻稻瘟病的研究中,对开展遗传图谱构建、基因定位与克隆、比较基因组学、cDNA指纹图谱、生物多样性研究、预测杂种优势等研究是一个十分实用的工具。本研究对辣椒SRAP反应体系的程序、模板、Mg2+等参数进行优化研究,结果表明:辣椒的PCR程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5循环,94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35循环,最后72℃延伸10min;25滋l反应体系中,模板量为15ng,Mg2+为2.0mmol/L。本研究建立的辣椒SRAP体系重复性好、稳定性强。

石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化

以陕西产野生石蒜〔Lycorisradiata (L’Hr.)Herb.〕为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对石蒜SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。优化后的反应体系总体积为10μL,含20ng模板DNA、3.0mmol·L-1Mg2+、0.20mmol·L-1dNTPs、0.4μmol·L-1引物和0.50UTaq DNA聚合酶。运用优化体系对9个石蒜居群的基因组DNA进行扩增,获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明SRAP-PCR可用于石蒜属植物的亲缘关系、系统演化、物种鉴别和遗传多样性等领域的研究。

菊花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs和引物浓度以及TaqDNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适合菊花〔Dendranthema×grandiflorum (Ramat.) Kitamura〕SRAP-PCR的反应体系。菊花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应体系总体积20μL,含3.125 mmol.L-1Mg2+、187.5μmol.L-1dNTPs、10.0μmol.L-1引物、50 ng模板DNA、0.5 UTaqDNA聚合酶及1×PCR buffer。各因素对菊花基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大,TaqDNA聚合酶用量的影响最小。运用菊花品种‘奥运含笑’和‘雨花落英’及二者的F1杂交后代单株的基因组DNA对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的菊花SRAP-PCR反应体系稳定可靠。

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2+2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。

百里香属植物ISSR-PCR和SRAP-PCR体系的确立及优化

通过对PCR扩增体系中的模板DNA用量,Mg2+、dNTPs和引物浓度的单因子实验,分别建立了适合百里香属(ThymusL.)植物总DNA的ISSR-PCR及SRAP-PCR优化反应体系。ISSR-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+3.75 mmol.L-1、dNTPs 0.20 mmol.L-1、引物0.3 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。SRAP-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+2.50 mmol.L-1、dNTPs 0.10mmol.L-1、引物0.4 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。运用优化的反应体系对百里香属植物地椒(T.quinque-costatusCelak.)、地椒的亚洲变种〔T.quinquecostatusvar.asiaticus(K itagawa)C.Y.W u etY.C.Huang〕和百里香(T.m ongolicusRonn.)15个居群的总DNA进行了ISSR和SRAP初步分析,获得了较好的扩增结果。

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系。结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol.L-1 Mg2+、300μmol.L-1 dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、4μmol.L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA。用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性。

荔枝SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝(Litchi chinensis Sonn)中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTP0.3mmol/L,引物5mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U。扩增程序为:94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃ 1 min、35℃ 1 min、72℃ 1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示:不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。

白木香SRAP-PCR反应体系的建立

本实验对白木香SRAP-PCR反应体系的影响因素(模板DNA,Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立白木香SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL):模板DNA50ng、引物0.30μmol/L、Mg2+1.5mmol/L、dNTP0.4mmol/L和Taq DNA聚合酶1.0U。适用于白木香的SRAP-PCR反应体系迄今未见报道,这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对白木香进行基础研究提供了一个标准化的程序。

桂花SRAP-PCR体系的确立及验证

以桂花〔Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.〕品种‘早银桂’的总DNA为模板,对SRAP-PCR扩增体系中的模板DNA用量,Mg2+、dNTPs和引物浓度以及TaqDNA聚合酶用量进行单因子实验,确立了适合桂花总DNA的SRAP-PCR反应体系:反应体系总体积10μL,包括30 ng模板DNA、2.5 mmol.L-1Mg2+、0.20 mmol.L-1dNTPs、0.4μmol.L-1上下游引物和0.75 UTaqDNA聚合酶及1×PCR buffer。采用SRAP引物组合pm21-em8,以78个桂花品种的总DNA为样品,对优化的SRAP-PCR反应体系进行初步验证,共扩增出632条带,多态性条带百分率75.32%;扩增位点15个,多态性位点百分率为86.67%。运用优化的SRAP-PCR体系,使用筛选出的18对SRAP引物组合对88个桂花品种、1个桂花野生种以及2个外类群〔柊树O.heterophyllus(G.Don)P.S.Green和华东木犀O.cooperiHemsl.〕的总DNA进行扩增,共扩增出296个位点,其中多态性位点248个,多态性位点百分率为83.78%。实验结果显示,运用优化的SRAP-PCR反应体系获得的DNA条带清晰、扩增结果稳定、多态性较丰富;SRAP分子标记可用于桂花遗传多样性、品种资源鉴定、亲缘关系以及系统进化等方面的研究。

苦楝SRAP-PCR反应体系的建立及优化

【目的】应用SRAP技术对苦楝Melia azedarach遗传多样性、种质资源鉴定等开展研究，对苦楝SRAP-PCR体系中的模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物和TaqDNA聚合酶5个组分浓度进行优化，建立适合苦楝的SRAP-PCR反应体系．【方法】采用单因素试验对反应体系中的5个因素分别设置8个浓度梯度水平，确定浓度范围后进行L16（4^5）正交试验设计，并对结果进行打分，确定优化体系．【结果和结论】SRAP对苦楝DNA浓度的要求不高，有一个较宽的浓度适宜范围；dNTPs在0．1～0．2mmol·L^-1范围内，能扩增出条带基本相同的清晰谱带；Mg^2＋为2．0mmol·L^-1左右时扩增条带较清晰且数量多；引物介于0．48～0．64μmol·L^-1均能扩增出带型基本保持一致且清晰的谱带；TaqDNA聚合酶在0．50～2．00U范围内可以得到清晰的带型．根据正交试验设计16个处理的得分，确定优化的反应体系为：模板DNA 30ng、dNTPs0．125mmol·L^-1、Mg^2＋ 2．25mmol·L^-1、引物0．48μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．75U，反应总体积25μL．

5种温带果树SRAP-PCR退火温度的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新型分子标记技术,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。有关SRAP-PCR反应体系的优化很少涉及到退火温度。因此,我们利用梯度PCR技术,对SRAP-PCR过程中的两步退火温度进行了研究,以期获得较好的退火温度组合。通过对第一步前5轮循环的退火温度梯度37～50℃的实验,其退火温度可提高到41℃;对第二步后30轮循环的退火温度梯度50～60℃的实验,其退火温度可提高到52℃。应用该程序在苹果、桃、板栗、梨和樱桃等5个树种各4个品种进行扩增,均获得了良好的结果。

野生濒危掌叶木SRAP-PCR体系的建立与优化

以野生濒危植物掌叶木的叶片为材料,通过正交试验与单因素试验相结合的方法,研究了模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度等因素对SRAP-PCR反应的影响,建立了适宜于掌叶木SRAP分析的扩增体系,即20μL的反应体系中含模板DNA约20 ng,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U。该研究为利用SRAP技术分析掌叶木遗传多样性、进行掌叶木种质资源相关研究等奠定了良好的基础。

部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新的分子标记技术,其技术简便、快速,不需预知序列信息,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。为了建立柿属植物SRAP技术体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA30ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,引物0.3μmol/L,反应总体积25μL。该体系在柿属植物6种1类型共29个基因型中获得较好的扩增结果,可望在柿属植物起源和进化研究中应用。

仙茅属植物SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因子和双因子实验对仙茅属植物SRAP-PCR反应体系中主要成分(Mg^(2+),dNTP、引物、模板和Taq DNA聚合酶)进行优化,并比较了琼脂糖凝胶电泳与非变性PAGE电泳的检测效果。建立了适合仙茅属植物SRAP分析的反应体系:25μL体系中内含1×PCR buffer、2.0 mmol/L Mg^(2+)、250μmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、40ng模板、1 U Taq酶。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高且带型清晰,能更准确反映仙茅属植物间的差异。优化的反应体系可以用于仙茅属植物的SRAP分析。

均匀设计优化杨属的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。

野生白及SRAP-PCR反应体系的优化

采用浓度梯度设计法研究适合白及的SRAP-PCR反应体系。对影响SRAP-PCR的DNA模板、引物、dNTP、Mg2+、Taq酶、退火温度等6个因素进行优化。最终确定白及的SRAP-PCR优化体系:在20μL体系中,DNA模板30 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.25μmol/L、引物20μmol/L、Taq酶2.0U,扩增体系为:94℃预变性5 min;5个循环的94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min;之后35个循环:94℃变性1 min,48℃退火1 min,72℃延伸1 min;72℃最后延伸5 min。该体系的建立为野生白及种质资源遗传多样性的进一步相关遗传分析奠定了基础。

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16(44)正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素(dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq聚合酶量)4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系:总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg2+浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。