烟草DNA的提取与SRAP反应体系的建立

以10个烟草栽培品种为试验材料,研究了烟草DNA的提取方法以及对建立烟草SRAP-PCR反应体系的影响因子设置梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应条件:在25μL的反应体系中,MgCl22.0mmol、dNTP200μmol,上下引物各30ng、DNA模板40ng、DNA聚合酶1.5U,扩增程序为:在94℃预变性5min,反应前5个循环在94℃1min,33℃1min,72℃1min条件下运行;随后的30个循环复性温度提高到53℃,最后72℃延伸5min。本文还讨论了不同分子标记在烟草中应用的优缺点以及SRAP分子标记在烟草上的应用前景,提出了应用SRAP分子标记构建烟草遗传图谱的可行性。

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20μL反应体系的最佳组合为:Taq聚合酶1.20μmol/min、Mg2+浓度1.25 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2μL 10×buffer(Mg2+free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、Mg2+、Taq聚合酶、Primer。

SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用

将SRAP与ISSR2种分子标记技术应用于8种甘蓝类植物(BrassicaoleraceaL.)的种子鉴别中。先以甘蓝(Brassicaoleraceavar.capitata)基因组DNA为模板,通过对SRAP、ISSR反应体系中各影响因素的逐一筛选,优化了甘蓝类植物SRAP、ISSR反应体系。进而采用30个SRAP引物组合和15个ISSR引物对白甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝的基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明M3-E5与M4-E5两个SRAP引物组合可以在8种甘蓝类植物之间显示较高的多态性;844和888两个ISSR引物也可在8种甘蓝类植物之间产生很好的多态,特别是844引物单独应用即可区分所有材料。

蓖麻DNA的提取及SRAP反应体系的建立

为建立蓖麻快速有效的DNA提取方法和SRAP标记的技术体系，本研究采用SDS法和CTAB法对蓖麻不同叶片（新鲜嫩叶、老叶和陈旧的嫩叶、老叶）的基因组DNA进行提取，并以DNA模板用量、Mg^2＋浓度、引物浓度和Taq酶用量4个因素的不同水平配制了10个反应体系对蓖麻SRAP反应体系进行优化。结果表明，SDS法和CTAB法均可获得较高质量的DNA，多数样品的A260／A280值介于1．7～1．9之间，但以CTAB法更为省工省时，不同叶片DNA的提取效果，以嫩叶效果最佳；设计的10个反应体系中，以反应体系A（总体积为15μL，40ng DNA模板，1．5mmol／L Mg^2＋浓度，0．2mmoL／L dNTPs，0．3μmol／L引物浓度和1Unit Taq酶）最为经济适用，将该体系用于蓖麻的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。本实验为蓖麻的遗传多样性研究及目标性状的分析定位提供了技术支撑。

黄瓜SRAP-PCR反应体系的建立

为了建立黄瓜适宜的SRAP(相关序列多态性)反应体系,以长形白皮少刺黄瓜B-2-2和圆形白皮黄瓜Y-3为材料,分析了不同来源的Taq酶及其浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度对扩增结果的影响,并比较了琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,在12.5μL反应体系中,Taq酶适用Takara酶,其最适用量为0.5U;DNA模板最适浓度为30 ng,Mg2+最适浓度为2.0 mmol/L,引物最适浓度为0.96μmol/L,dNTP最适浓度为200μmol/L。6%的变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物效果比琼脂糖检测效果好。用不同黄瓜材料的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,6对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带。因而建立的黄瓜SRAP反应体系稳定可靠。

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。

南瓜SRAP扩增体系与扩增程序的优化

利用L45正交设计对影响南瓜SRAP反应体系的MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度及模板DNA浓度等5个因素进行了筛选,快速得到稳定性和重复性好的南瓜SRAP扩增体系。对复性温度、PCR循环次数等影响南瓜SRAP扩增结果的重要因素进行了优化。最终优化的南瓜SRAP反应体系为25μL反应液中:10×buffer2.5μL,0.2 mmol/L dNTPs,引物0.2μmol/L,1.5 mmol/LMgCl2,DNA模板6 ng/μL,Taq酶1.5 U。本研究最终确立的PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,35℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行5个循环,94℃变性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸90 s,进行32个循环,最后72℃延伸5 min。在此条件下得到的SRAP标记可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供稳定有效的手段。

SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用

利用正交设计,首次对西藏木瓜属植物SRAP-PCR反应体系中的引物浓度、Taq酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+在4个水平上进行优化,建立了木瓜属植物SRAP-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,引物浓度0.4μmol·L-1,Taq酶1.0U,dNTPs浓度0.3mmol·L-1,模板DNA70ng,Mg2+浓度2.0mmol·L-1。用引物组合M1E7和M3E18检验上述优化体系,结果显示该体系具有较高稳定性。在此基础上,用筛选的28对SRAP引物组合对21份西藏野生木瓜资源总DNA进行SRAP-PCR扩增,共检测出420个位点,其中多态性位点数363个,多态性位点百分率为86.67%。为此,SRAP分子标记可用于木瓜属植物遗传多样性的研究。

湖南宽皮柑橘SRAP的反应体系

为研究湖南宽皮柑橘的血缘与起源关系,以湖南宽皮柑橘为试验材料,探讨其SRAP分子标记的反应体系.结果表明:设计并筛选了110对引物,其中28对引物扩增带型丰富,以引物组合Me5-Em11、Me9-Em10多态性最高,研究确定在25μL的反应体系中,Mg2+浓度在1.5 mmol.L-1,dNTP 0.3 mmol.L-1,上下引物各为0.2μmol.L-1,Taq酶浓度为0.3 U效果好,最佳PCR程序为94℃预变性5 min,然后94℃,1 min;50℃,1 min;72℃,1 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,利用优化后的反应体系成功构建了湖南宽皮柑橘的指纹图谱.

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2+2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。

荔枝SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP(sequence-related amplified polymorphism)是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝(Litchi chinensis Sonn)中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为:在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg2+浓度2.5mmol/L,dNTP0.3mmol/L,引物5mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U。扩增程序为:94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃ 1 min、35℃ 1 min、72℃ 1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示:不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。

青葙SRAP体系的建立和优化

目的探讨影响青葙SRAP(sequence-related amplified polymorphism)扩增的各种因素,建立并优化青葙SRAP反应体系,为分子水平鉴定青葙子及其伪品,探讨青葙不同种质间的亲缘关系奠定基础。方法用CTAB法提取青葙DAN,设计Taq酶浓度(0.02、0.04、0.06U/μL)、dNTP浓度(0.10、0.20、0.30mmol/L)、Primer浓度(0.15、0.30、0.45μmol/L)3水平3因素试验和Mg2+浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/L)8水平单因素试验。在25μL体系中加入模板DNA20ng,对体系进行优化,用琼脂糖进行检测。结果建立了适合青葙的SRAP体系,在25μL体系中,DNA为20ng,Taq酶浓度为0.04U/μL,dNTP浓度为0.30mmol/L,Primer浓度为0.30μmol/L,Mg2+浓度为2.5mmol/L,优化后的体系目标条带增多,且比较稳定,重现性好,得到了较好的扩增效果。结论本研究建立的反应体系适合青葙SRAP的研究。为从分子水平鉴定青葙子正品与伪品以及鉴定青葙不同种质资源奠定了基础。

药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化

基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果表明:药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为:在20μl的反应体系中,模板DNA60ng,Taq酶1.00U,Mg2+2.00mmol/L,dNTP0.20mmol/L,引物0.40μmol/L。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。

黄花蒿SRAP-PCR反应体系的建立与优化

目的用序列相关扩增多态性(SRAP)这一新的分子标记技术建立稳定可重复的黄花蒿Artemisia annua的SRAP最佳反应体系。方法以黄花蒿DNA为模板,分析了SRAP反应体系中的一些重要参数对PCR扩增的影响。结果建立了稳定可重复的SRAP反应体系;25μL反应体系中,模板DNA为30～105ng,MgCl2为2.0mmol/L,dNTP为0.25mmol/L,Taq酶为1.0U,引物为2.0μmol/L;扩增程序:94℃预变性3min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min。结论本研究建立的黄花蒿SRAP体系重复性好,稳定性强。

能源植物芒的SRAP分子标记体系建立与优化

以芒总DNA为材料,利用单因素分析法对影响SRAP反应体系的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶等3个因素进行了优化。研究结果表明:最佳的10μL反应体系为1μL10×TaqBuffer、DNA20ng、Mg2+2mmol/L、dNTPs0.5mmol/L、TaqDNA聚合酶0.6U、正反向Primer浓度均为0.8μmol/L。SRAP-PCR反应体系的建立和优化,为今后利用SRAP标记技术开展芒的遗传多样性研究和分子标记辅助选择育种研究提供了一个技术支持。

百里香属植物ISSR-PCR和SRAP-PCR体系的确立及优化

通过对PCR扩增体系中的模板DNA用量,Mg2+、dNTPs和引物浓度的单因子实验,分别建立了适合百里香属(ThymusL.)植物总DNA的ISSR-PCR及SRAP-PCR优化反应体系。ISSR-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+3.75 mmol.L-1、dNTPs 0.20 mmol.L-1、引物0.3 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。SRAP-PCR优化反应体系为:反应总体积20μL,含模板DNA 30 ng、Mg2+2.50 mmol.L-1、dNTPs 0.10mmol.L-1、引物0.4 mmol.L-1和TaqDNA聚合酶1 U。运用优化的反应体系对百里香属植物地椒(T.quinque-costatusCelak.)、地椒的亚洲变种〔T.quinquecostatusvar.asiaticus(K itagawa)C.Y.W u etY.C.Huang〕和百里香(T.m ongolicusRonn.)15个居群的总DNA进行了ISSR和SRAP初步分析,获得了较好的扩增结果。

红椿SRAP反应体系优化及引物筛选

[目的]优化相关序列扩增多态性(SRAP)体系内的不同组分,建立适用于红椿SRAP分子标记的反应体系,并进一步从SRAP引物组合中筛选出稳定、多态性好的引物组合,为红椿遗传多样性研究奠定试验基础。[方法]针对SRAP-PCR反应体系中5个因素各设置8个水平,先利用单因素试验确定浓度梯度,后在确定的梯度范围内选定4个水平,按照正交试验L16(45)进行优化,结合正交直观分析法和新复极差法对各因素进行优化筛选。[结果]确定最优体系为总体系25μL,模板DNA 25 ng,上下游引物各0.3μmol·L^(-1),Taq DNA聚合酶1U,Mg2+2.5 mmol·L^(-1),d NTP 0.3 mmol·L^(-1)。利用稳定的SRAP-PCR体系,从1 505对SRAP引物组合中筛选出30对优质引物组合。[结论]通过不同种源红椿基因组DNA的重复验证,获得了稳定清晰、多态性较强的扩增条带,表明所确定的最优体系稳定可靠,适用性较强,可用于不同种源红椿遗传多样性研究的后续实验。

芝麻SRAP反应体系的建立与优化

通过对芝麻SRAP反应体系主要影响因素进行优化,建立最佳反应体系。以芝麻幼叶提取的DNA为实验材料,对影响SRAP扩增结果的重要反应因素dNTPs、Mg2+、Taq酶、随机引物及模板DNA设置不同梯度实验,得到了芝麻扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的SRAP最佳反应体系为:dNTPs(10mmol/L)0.30μl,Mg2+(25mmol/L)1.20μl,Taq酶1.00U,正反引物各50ng,DNA模板80ng,10×Buffer1.5μl,总体积15μl,为SRAP标记技术在芝麻分子生物学研究方面的应用奠定了基础。

莲SRAP-PCR反应体系的优化与建立

以中国古代莲(Nelumbo nucifera)和美洲黄莲(N.lutea)为材料,利用单因素分析法对影响莲SRAP-PCR扩增效果的模板、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物浓度进行了探索和研究。获得了能稳定扩增莲基因组的SRAP-PCR最佳10μL反应体系:模板DNA浓度为50 ng、1μL 10×Buffer、MgCl2浓度为2 mmol/L、dNTPs浓度为0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.75 U、正反向引物浓度均为0.8μmol/L。为检测该优化体系的稳定性,进一步选取16对引物组合对88份花莲核心种质进行PCR扩增,获得了183条清晰的谱带,其中165条具有多态性,比率为90%,说明建立的莲SRAP反应体系是稳定可靠的。莲SRAP-PCR反应体系的优化和建立,为利用SRAP标记技术深入开展莲的遗传多样性评价、遗传连锁图构建和分子辅助育种等研究提供成熟的技术体系支撑。

苔藓植物SRAP反应体系的优化

以黄灰藓总DNA为材料,对影响SRAP-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了优化,分析了各因素对SRAP-PCR扩增结果的影响。结果表明,在25μLSRAP-PCR反应体系中,最佳反应条件为:模板DNA40ng;Mg2+浓度2.0mmol/L;dNTP浓度0.2mmol/L;正反引物15pmol;TaqDNA聚合酶2.0U。在此条件下,引物组合Me5/em7对13种苔藓植物扩增的条带清晰、多态性好,表明此反应条件适合于苔藓植物的SRAP-PCR反应体系。