转基因水稻感染SRBSDV后对植株营养物质的影响

以3个转基因水稻品种为研究对象,通过接种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)后测定水稻植株株高、可溶性糖含量、碳氮含量和氨基酸含量的变化,以明确SRBSDV侵染后诱导的水稻形态以及营养成分的变化。研究结果表明,MH63、T1C-19、T2A-1在感染SRBSDV后株高显著下降,可溶性糖含量与正常水稻无显著性差异。MH63、T1C-19在感染SRBSDV后氮含量显著提高,T2A-1水稻感染SRBSDV后碳含量显著提高。感染SRBSDV后MH63、T1C-19、T2A-1体内各种氨基酸及总氨基酸含量均提高。

组织蛋白酶D有助于SRBSDV在白背飞虱体内复制

在白背飞虱(Sogatella furcifera)获毒过程中,南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV)与细胞膜上受体结合,借助网格蛋白依赖型内吞作用进入宿主细胞。组织蛋白酶D(Cathepsin D,CathD)是一种天冬氨酸蛋白酶,参与细胞内体/溶酶体内蛋白降解和病毒释放进入细胞质过程,但CathD在SRBSDV侵染其介体白背飞虱时是否发挥作用目前尚不明确。通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默白背飞虱体内CathD基因的表达,发现沉默表达CathD基因的白背飞虱在饲喂SRBSDV后的存活率与对照组白背飞虱相比无明显差异,但会降低白背飞虱的带毒比率和带毒量;在果蝇细胞中敲低CathD同源基因的表达并感染果蝇C病毒(Drosophila C virus,DCV),细胞内DCV的复制水平与对照组相比也有明显下调。研究结果提示CathD可能通过一种保守的机制协助病毒在昆虫细胞内增殖,可以作为防控SRBSDV病害的潜在靶标分子。

南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病抗病遗传资源与分子机理研究进展

南方水稻黑条矮缩病(Souther rice black-streaked dwarf virus disease,SRBSDVD)是依靠白背飞虱(Sogatella furcifera)为传播介体,由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)侵染引起的一种水稻病毒病。该病害于2001年在我国华南地区首次被发现,随后发生面积不断扩大,危害逐年加重,已成为近年来危害中国南方稻区水稻生产的重要病害之一。白背飞虱迁飞性强、种群数量大、传毒持久等特点,导致化学农药防虫治病效果并不理想,至今还未有可持续和绿色控制SRBSDVD的手段。根据病原病毒的爆发性及其传播介体白背飞虱的生物学特性,预计该病害在未来较长的一段时期内将是我国最严重的水稻病害之一,很有可能再次暴发流行。因此,当前生产上急需培育出能够抵御SRBSDVD的抗性水稻品种。本文综述了SRBSDVD的发病规律、抗病种质资源的收集与评估、抗病基因或数量性状位点(QTL)的精确定位,以及这些抗性基因的分子作用机制,进一步探讨了利用现代分子生物学技术,包括分子标记辅助选择、基因沉默(RNAi)和基因编辑等技术加快SRBSDVD抗病品种的选育,可为今后有效控制SRBSDVD提供基础。

温度、水稻生育期和白背飞虱若虫龄期对南方水稻黑条矮缩病毒介体获毒率的影响

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是由白背飞虱(Sogatella furcifera)传播的一种新病毒。为明确白背飞虱获毒的影响因子及南方水稻黑条矮缩病的流行规律,本文采用三因素试验,研究温度(22、27和32℃)、水稻生育期(三叶期、分蘖期和孕穗期)和白背飞虱若虫龄期(3龄和5龄)对白背飞虱获毒效率的影响。结果表明,白背飞虱在27℃和32℃下的获毒率显著高于22℃下的获毒率;在不同生育期水稻上,白背飞虱在分蘖期水稻上的获毒率高于三叶期和孕穗期;白背飞虱若虫龄期也显著影响获毒率,3龄若虫获毒率高于5龄若虫;但这些因素的交互作用对白背飞虱的获毒率无显著影响。

白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建

白背飞虱(Sogatella furcifera Horváth)作为一种迁飞性害虫,不仅自身危害水稻,而且以持久性方式传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。为了研究白背飞虱与SRBSDV之间的相互作用,需要构建一个高质量的酵母筛选文库,试验利用Gateway技术构建了白背飞虱cDNA酵母表达文库,检测分析显示,白背飞虱初级文库库容量约为1.72×10~7CFU,cDNA插入片段主要分布在500~2 000 bp,重组率约为95.8%;次级文库库容量约为1.73×10~7CFU,cDNA插入片段主要分布在400~2 000bp,重组率为100%;Y187酵母菌株的白背飞虱酵母双杂交cDNA文库库容量约5.09×10~7CFU,插入片段大小在750~2 000 bp,重组率100%,再随机挑选36个单克隆进行测序分析,所得结果与Gen Bank数据库比对显示36个克隆中含有22个不同的基因,长度在750~2 000 bp,这些分析表明,该文库可以用于酵母双杂交的后续筛选,为研究白背飞虱与SRBSDV之间的互作奠定了基础。

西南稻区稻飞虱及引起水稻矮缩病病毒的分布研究

2010-2012年5-8月在西南稻区的四川、云南、广西、贵州和重庆等地对稻飞虱及其传播病毒病植株进行田间调查和室内鉴定.结果表明,白背飞虱在西南地区分布最广,且在各个调查均有发现;褐飞虱主要分布在西南稻区的东部和南部,四川盆地西部未见;而灰飞虱则主要分布在温度较低的滇西高原和四川盆地北部甚至更北的西南稻区,并在飞虱危害较轻的2011年成为田间优势种群;除滇西高原外,西南稻区各地水稻生长季节部分白背飞虱携带南方水稻黑条矮缩病毒,带毒率在2.5％～10.0％之间;南方水稻黑条矮缩病是西南稻区水稻当前最主要病毒病,历年在贵州东南部发生危害,部分田块矮化株带毒率达到100.0％,但在滇西高原和四川盆地未见其危害;在褐飞虱和白背飞虱混合发生地区,南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒能复合侵染水稻;而在白背飞虱和灰飞虱混合发生地区的云南保山发现有水稻条纹叶枯病,在四川新都则发现了水稻黑条矮缩病.

南方水稻黑条矮缩病毒快速检测

南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的新水稻矮缩病近年在越南北部和我国南方各省爆发,准确快速地检测病毒是病害预测的关键。本文针对该病毒的S10序列设计了一对新的引物S10F/S10R,利用一步法RT-PCR,对2010年5~8月间湖南省下属各县送来的疑似感染该病毒引起的水稻矮缩病样本进行了检测,结果显示,新引物能有效地区分阳性样品和非阳性样品。同时对PCR产物进行了序列测定,结果表明序列均与已发表的南方水稻黑条矮缩病毒序列(登录号:EU523360和EU784840)达约99%的同源性。还在此基础上构建了系统发育树,发现SRBSDV湖南、广东和海南分离物病毒位于一个相对独立的分支。研究发现相对以往的巢式RT-PCR,本文采用的新引物及一步法RT-PCR能快速检测南方水稻黑条矮缩病毒,简化了操作步骤,缩短了检测时间,适合在SRBSDV检测和病害预测中应用。

毒氟磷防治南方水稻黑条矮缩病药效研究

为明确自主创制新抗病毒药剂——30%毒氟磷WP对南方水稻黑条矮缩病的防控效果以及探讨防治该病的理想药剂组合,采用喷雾施药法对30%毒氟磷WP、25%吡蚜·噻虫嗪SC、10%醚菊脂MG、8%宁南霉素AS的单用或混用处理进行研究。结果表明,在大田分蘖初期,以25%吡蚜·噻虫嗪SC375mL/hm2和30%毒氟磷WP990g/hm2的药剂组合的防治效果最好,防效为66.67%,25%吡蚜·噻虫嗪SC、10%醚菊脂MG、30%毒氟磷WP和8%宁南霉素AS的防效分别为50.51%、33.33%、33.33%、17.12%;在收割期,以25%吡蚜·噻虫嗪SC375mL/hm2和30%毒氟磷WP990g/hm2的药剂组合的防治效果最好,防效为73.24%,25%吡蚜·噻虫嗪SC375mL/hm2、10%醚菊脂MG450g/hm2、30%毒氟磷WP990g/hm2和8%宁南霉素AS750mL/hm2处理组的防效依次是46.48%、45.07%、43.66%、42.25%。同时,测产试验结果表明:与CK相比,增产效果最明显的是25%吡蚜·噻虫嗪SC375mL/hm2和30%毒氟磷WP990g/hm2组合,增产值为292.35%,而25%吡蚜·噻虫嗪SC、10%醚菊脂MG、30%毒氟磷WP和8%宁南霉素AS的增产值为249.75%、230.7%、208.65%、104.7%。因此,为有效防治南方水稻黑条矮缩病,可采用本研究中的杀虫剂和抗病毒剂的联合处理,特别是在秧田期用药。

江西省白背飞虱消长动态及南方水稻黑条矮缩病带毒率的测定

为明确白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)的消长动态及其对南方水稻黑条矮缩病带毒率的影响,分别采用诱虫灯测报和田间取样方法测定江西省崇义、井冈山、莲花和万安等4个县(市)灯下和水稻田间白背飞虱的消长动态,并采用RT-PCR方法测定4个县(市)不同时期灯下和水稻田间白背飞虱的带毒率。结果表明:江西省4个县(市)灯下和田间白背飞虱消长动态与带毒率变化规律相同,即白背飞虱高发期其带毒率也较高。崇义和万安白背飞虱及南方水稻黑条矮缩病发生高峰期较早,在7月28日左右;其次是井冈山,高峰期在8月8日左右;莲花则最晚,高峰期在8月18日左右。根据白背飞虱发生高峰期的时间差异,可以推测携带南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的白背飞虱是从东南方向传入江西省的,并进一步传播到邻近省份。

南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p10的原核表达和抗血清制备及应用

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清。ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断。

浙江武义2009年南方水稻黑条矮缩病的毒源地分析

2009年,浙江省境内首次出现南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV),且仅武义县有发病现象。因为该病毒病是一种虫媒病毒,且白背飞虱Sogatella furcifera(Horváth)是主要传毒介体,所以本文通过白背飞虱灯下诱虫情况调查、迁飞轨迹模拟、天气学背景分析以及毒源地分析,阐释了2009年浙江省武义县发现的南方水稻黑条矮缩病的供毒源地分布情况,以及白背飞虱携毒的传递路径,并讨论了轨迹模拟中各生物学参数的设定方法,从而为剖析该病毒的宏观流行规律奠定科学基础。结果显示:(1)通过对白背飞虱迁入武义的主要虫源地与经鉴定的南方水稻黑条矮缩病发病区域的叠加分析,明确了浙江武义的可能毒源地分布于两广、闽南、赣南四省区境内;(2)西南低空急流及偏南气流是白背飞虱将我国南方的病毒远距离传送到武义县境内的动力源;(3)白背飞虱随下沉气流和降雨在武义境内的集中降落是南方水稻黑条矮缩病在当地暴发的触发条件。

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。

广东省西南部南方水稻黑条矮缩病越冬调查初报

摸清南方水稻黑条矮缩病病原越冬情况,为南方水稻黑条矮缩病的预测预报和综合治理提供科学依据。2013年3—4月采用普查和抽查相结合的方法,对地处广东省西南部的化州市南方水稻黑条矮缩病病原越冬情况进行调查和研究。结果表明:化州市存在大面积、高密度的南方水稻黑条矮缩病越冬区域,越冬面积0.37万hm2,平均病丛率13.3%,最高达68.3%。初步分析出该年度再生稻发生南方水稻黑条矮缩病与气候条件和上年田间病毒源有关。明确了南方水稻黑条矮缩病在化州地区冬季再生稻可顺利越冬,研究结果可为南方水稻黑条矮缩病的有效防治提供技术支撑。

南方水稻黑条矮缩病毒江西分离物CP基因克隆及序列分析

根据GenBank已登陆的SRBSDV S10核苷酸序列设计引物,克隆SRBSDV江西分离物外壳蛋白(CP)基因,结合已公布的序列,通过生物信息学方法进行序列分析。结果表明,SRBSDV江西分离物CP基因全长1 674个核苷酸,推测编码557个氨基酸,与已报道的SRBSDV CP基因之间核苷酸同源性为97.5%～100%,氨基酸同源性为97.7%～100%。SRBSDV CP基因核苷酸序列高度保守,保守位点占全部位点的83.5%。没有发现重组事件。本研究首次报道根据系统发育进化树,SRBSDV可分为2大组群,不存在明显的地域和寄主分化。

广西南方水稻黑条矮缩病毒及水稻齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】探索南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的分子检测技术,了解两种病毒在广西的分布,为生产上开展两种病害的防治奠定基础。【方法】用RT-PCR技术检测采自广西各地的水稻、杂草及稻飞虱样品;用CF-11纤维素粉提取水稻茎叶组织中的dsRNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察dsRNA图谱。【结果】从水稻、稗草、五节芒、李氏禾和白背飞虱样品中获得850bp左右的SRBSDV序列,从水稻和褐飞虱样品中获得700bp左右的RRSV序列;首次从五节芒和李氏禾中检测到SRBSDV。SRBSDV单独侵染、SRBSDV和RRSV复合侵染可见8条dsRNA条带,但带谱不一致;RRSV单独侵染可见5条dsRNA带。在供检测的181株水稻样品中,除了来自北海、贵港和梧州市的水稻样品外,其余样品均检测到SRBSDV;除了来自梧州、贺州、玉林、贵港和来宾的水稻样品外,其余样品均检测出RRSV;其中带SRBSDV的样品数占44.8%,带RRSV的样品占21.5%,两种病毒复合感染占11.0%。【结论】研究设计的特异性引物能用于RT-PCR检测SRBSDV和RRSV、水稻样品提取dsRNA能快速直观地鉴定SRBSDV、RRSV单独感染及混合感染水稻。用设计的引物首次检测出SRBSDV的两种新寄主五节芒和李氏禾。

南方水稻黑条矮缩病毒诱导的水稻挥发物及白背飞虱成虫对其组分的行为反应

【目的】南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是白背飞虱Sogatella furcifera在稻苗间传播的一种持久性病毒。本研究旨在调查SRBSDV是否诱导水稻挥发物的含量及成分发生变化,并探究变化的组分是否对白背飞虱具引诱或驱避作用。【方法】采用动态顶空法收集3个水稻品种病/健植株的挥发物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析各品种不同生育期病/健株挥发物的组分,使用嗅觉测定仪测定了白背飞虱对病株特有挥发物的嗅觉行为反应。【结果】从健株检测到11大类化合物共36种;从病株检测到12大类化合物共37种。病株特有挥发物12种,即正十六烷、癸醚、butyl octyl phthalate、正十八烷、己二酸二异丁酯、正十五碳醛、十六烷酸甲酯、2-methylhexacosane、二苯甲酮、雪松醇、正二十烷和叶绿醇;病/健株中共有但含量差异显著的挥发物6种,即1-tricosene、octadecanal、萘、植酮、正十二烷醇和2,6-二叔丁基对甲酚。嗅觉选择实验表明,在50μL/L浓度下,仅叶绿醇对白背飞虱成虫(健康与饲毒)表现出显著的驱避活性。【结论】SRBSDV的侵染改变了水稻挥发物的组分,且不同品种、不同生育期挥发物组分均具差异。叶绿醇为孕穗期荣优华占病株特有挥发物,对健康与饲毒白背飞虱均有驱避活性,是否有助于促进该病毒传播,尚需进一步验证。

南方水稻黑条矮缩病空间分布型及抽样技术

为了探讨南方水稻黑条矮缩病空间分布型及抽样技术,为该病害的准确抽样调查和有效防治提供依据,选取13块稻田逐丛调查资料,应用聚集度指标法、Iwao法和Taylor幂法则,研究了广东西南部南方水稻黑条矮缩病在稻田的空间分布型和抽样技术。结果表明,南方水稻黑条矮缩病病丛空间分布格局随着病丛密度的提高逐步从聚集型向均匀型演变发展。m*-m回归分析表明病丛空间分布的基本成分是个体群,个体间相互吸引,个体群的空间分布型为均匀分布。Taylor幂法则分析表明,南方水稻黑条矮缩病病丛个体的空间分布随着病丛密度的提高而趋向均匀分布。根据南方水稻黑条矮缩病病丛以均匀为主的空间分布特性,田间抽样调查以采用五点或对角线法等较宜。在此基础上提出了理论抽样数:n=(1.96)2/D2(1.287 1/珚x+0.079 9)。

感染和未感染南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱成虫唾液腺转录组比较分析

【目的】白背飞虱Sogatella furcifera是南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)传播的主要介体,其唾液腺在取食和传毒的过程中都发挥着重要作用,本研究旨在通过对带毒与不带毒白背飞虱成虫的唾液腺进行转录组测序,进而比较分析找出差异表达基因,推测出唾液腺中与传毒相关的基因。【方法】利用Ion ProtonⅡ,PGM平台进行带毒与不带毒白背飞虱成虫唾液腺转录组测序,用SOAPdenovo软件从头组装,通过blast X比对进行基因注释。采用Blast2go和Blastall软件对所测基因的GO功能富集和KEGG代谢途径进行分析;釆用RPKM分析差异表达基因。【结果】带毒和不带毒白背飞虱的唾液腺转录组样本的原始数据经过软件处理后分别获得52 062和51 407条unigenes序列(GenBank登录号分别为SRS851833和SRS843978),平均长度分别为639和647 bp。通过NR数据库比对,共18 431个unigenes具有同源序列,与赤拟谷盗Tribolium castaneum的同源序列最多(16.23%)。所有unigenes富集到52个GO类群,240个KEGG信号通路。白背飞虱在感染南方水稻黑条矮缩病毒后,唾液腺有89个unigenes序列的表达发生变化。【结论】本研究通过比较分析带毒与不带毒白背飞虱唾液腺转录组样本后,发现有部分基因序列的表达存在差异,这些基因序列可能和病毒与载体的互作有关。转录组数据的获得为研究与取食和传毒相关的基因提供了有用的信息,从而在分子水平上为后续研究白背飞虱与SRBSDV互作机制奠定基础。

南方水稻黑条矮缩病毒P6抗体的制备及应用

为了建立快速准确检测田间介体白背飞虱带毒率的方法,利用Gateway重组技术将与病毒早期复制有关的P6基因的N端993 bp构建原核表达载体pDEST17-P6,并将诱导表达的目的蛋白免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果表明:Western blot检测制备的P6抗体可特异性检测SRBSDV侵染水稻的P6蛋白,免疫荧光标记技术可检测南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV)侵染白背飞虱体内的P6蛋白,且P6抗体可直观高效准确地用于免疫荧光标记检测昆虫带毒率。以上研究表明,所制备的P6抗体可用于SRBSDV的田间介体昆虫带毒率快速检测,有助于病毒病害的监测和预报。