基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.

萝卜RsSRK-a基因cDNA克隆与表达特性分析

以萝卜Nau-DY06为试材,采用亲和指数和荧光显微镜进行自交不亲和性测定,结果表明其为稳定自交不亲和系。根据不同作物SRK基因保守序列设计特异引物,以Nau-DY06柱头为材料,采用RT-PCR扩增获得SRK基因cDNA序列,包含2562bp开放阅读框(ORF),命名为RsSRK-a(GenBank登录号:GQ121139)。该基因cDNA序列编码853个氨基酸,其核苷酸序列与甘蓝型油菜SRK3、羽衣甘蓝SRK13-b基因同源性均为89%。RsSRK-a基因序列编码的蛋白质相对分子质量为96.6×103,等电点为6.69。半定量RT-PCR分析表明,RsSRK-a基因在自交不亲和系花期柱头中表达量远远高于蕾期柱头,而在植株的其他部位均不表达,表明SRK基因与自交不亲和特性表达密切相关。

灯盏花自交不亲和SRK基因编码区甲基化分析

为研究灯盏花自交不亲和基因SRK(Eb SRK)的DNA甲基化变异,本文利用甲基化敏感限制性内切酶-PCR法,对Eb SRK基因中包含CCGG位点的部分编码区进行甲基化分析,同时,利用RT-PCR检测Eb SRK基因在灯盏花不同组织中的表达情况。实验结果显示,Eb SRK基因中的两个CCGG位点不存在甲基化,而Eb SRK基因在不同组织该基因的表达量有显著的差异性。这说明对Eb SRK等位基因的抑制不是由于Eb SRK基因中CCGG位点甲基化引起,而存在其他的调控机理。

基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证

根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子SRK基因保守序列设计简并引物,克隆23份甘蓝自交不亲和系SRK基因并测序。利用NCBI数据库进行克隆序列的Blast比较以及序列之间的相似性分析,初步确定23份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68等10种S单倍型。其中有5份甘蓝自交不亲和系属于SRK36单倍型,占参试自交不亲和系的22%;SRK7、SRK16和SRK58单倍型均只有1份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察,并对20个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析,结果表明根据SRK基因序列所确定的相同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和,花粉在柱头上萌发受阻,花期亲和指数低;而不同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和,花粉管伸入雌蕊正常,花期亲和指数高。表明基于SRK基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是一种简单而可靠的快速鉴定方法,有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制,从而提高育种效率。

芸薹属植物自交不亲和性的分子机制

芸薹属植物自交不亲和性受单一位点的复等位基因控制 ,此位点命名为S位点。它决定柱头表面花粉识别的专一性。S位点糖蛋白基因 (SLG)和S受体激酶基因 (SRK)是控制芸薹属植物花柱自交不亲和性的两个关键因子。本文介绍了编码自交不亲和性的S位点的SLG、SRK和花粉S基因的鉴定、结构及功能 ,并对其信号传导途径的可能机制做了简要概述。

两个甘蓝自交系自交不亲和S单元型的初步鉴定

根据甘蓝SRK基因序列保守区设计特异性引物,通过PCR扩增和克隆测序,结合生物信息学分析方法对两个甘蓝自交系材料的S单元型进行初步鉴定。BLAST分析表明:甘蓝自交系96-100与Brassica oleracea的SRK29基因核苷酸序列相似性最高(91%),但蛋白序列与S14相似性最高(在84%的序列覆盖度下相似性达100%)。自交系俄引165与Brassica oleracea的BoSRK28基因核苷酸序列相似性达100%,推测其S单元型为S28。

青花菜高代自交系S单元型的鉴定及SRK基因表达分析

根据SRK和SCR/SP11基因序列保守区设计特异性引物,通过PCR扩增和克隆、测序并结合生物信息学分析,对70份青花菜高代自交系的S单元型进行鉴定,并利用亲和指数法对分子鉴定结果进行验证,最后通过qRT-PCR对SRK基因的表达模式进行分析.结果表明,70份材料分别属于16个S单元型.亲和指数法鉴定结果与分子鉴定结果基本一致,验证了分子鉴定结果的准确性.对SRK基因的表达研究发现,蕾期授粉后SRK基因表达量变化不大,花期授粉后SRK基因表达量显著上调,授粉后6 h时表达量最高.说明SRK基因表达量变化取决于是否处在开花期,开花后SRK基因较为敏感.

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16~421bp的片段和SCR第1876~2068bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。