山西省及周边地区利什曼原虫SSU rRNA基因和ITS-1序列克隆及序列系统进化分析

为了解山西及周边地区内脏利什曼病的病原体利什曼原虫(Leishmania spp.)的虫种类型及其基因多态性,使用首都医科大学附属北京友谊医院收治的13例来自山西及周边地区的内脏利什曼病患者的骨髓样本提取DNA,分别扩增其核糖体小亚基rRNA(small subunit ribosomal RNA,SSU rRNA)和核糖体DNA内转录间隔区Ⅰ(ITS-1)并应用其序列构建系统发育树确定患者感染原虫的虫种类型及其遗传关系。结果显示,13个临床样本SSU rRNA和ITS-1序列同源性分别为99.59%和99.93%。基于SSU rRNA构建的系统发育树显示13个患者感染的虫种与杜氏利什曼原虫L.donovani、婴儿利什曼原虫L.infantum和恰氏利什曼原虫L.chagasi聚为一支。基于ITS-1构建的系统发育树显示13例患者感染的利什曼原虫均属于婴儿利什曼原虫。SSU rRNA与ITS-1序列分类的结果一致,ITS-1在利什曼原虫虫种鉴定上较SSU rRNA分辨率高,可鉴定到亚种水平。13例山西及周边地区利什曼病患者感染原虫均为婴儿利什曼原虫L.infantum,感染虫株间同源性较高。

陕西省韩城市利什曼原虫SSU rRNA基因系统发育研究

目的了解陕西省韩城市黑热病区利什曼原虫种类及分子遗传特征。方法对来自韩城市的利什曼原虫阳性标本,进行SSU rRNA基因序列扩增,扩增产物进行测序,与其它不同种类、不同地区利什曼原虫的SSU rRNA基因序列进行比对,分析突变位点规律,建立系统发育树。结果有3份标本SSU rRNA基因序列扩增测序成功,其基因序列与杜氏利什曼原虫、夏科氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的SSU rRNA序列同源性较高,与婴儿利什曼原虫在UQ-II突变区有一个位点的变异,并与新疆荒漠虫株、甘肃省利什曼虫株聚为一类。结论结合流行病学与SSU rRNA序列分析结果,陕西省韩城市黑热病病原体应为婴儿利什曼原虫。

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的 建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。 方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。 结果 C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .

利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫分子系统发育学

目的利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫基因多态性及其分子系统发育学。方法采用PCR法获得中国不同地区利什曼原虫SSU rDNA,通过Clustal X软件比对序列碱基,构建贝叶斯进化树。结果中国不同地区流行利什曼原虫分属于不同的支序,在中国除了有杜氏利什曼原虫外,还有热带利什曼原虫和一支在国际上还没有定种的未定种存在。结论在中国有未定种利什曼原虫存在。

裳卷蛾变形孢虫SSU rRNA核心序列的克隆与系统发育分析

【目的】利用分子生物学手段探索裳卷蛾变形孢虫的遗传发育地位。【方法】微孢子虫的SSUr RNA序列是构建系统发育进化树的重要工具。试验通过T-A克隆法对裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces)SSU rRNA核心序列进行了克隆,并采用近邻法构建了系统发育进化树。【结果】克隆得到了长为1228bp的核苷酸序列(GenBank EU267796)。系统发育分析结果表明:裳卷蛾变形孢虫与分离于小菜蛾(Plutella xylostella)的Vairimorpha sp.Germany(GenBank AF124331)和Vairimorpha imperfecta(GenBank AJ131645)相似性最高,它们在系统发育进化树中与寄主为鳞翅目昆虫的Nosema属聚为一类,与纳卡变形孢虫(Vairimorpha necatrix)为代表的Vairimorpha属为相邻集。【结论】结合其生物学特征,裳卷蛾变形孢虫确实为Vairimorph a属的成员,但根据系统发育分析归入Nosematidae科可能更为合适。

新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体SSU rRNA基因及kDNA的PCR-SSCP分析

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术，对皮肤利什曼病（ＣＬ）病人（Ｐ１７）的病原体ＳＳＵｒＲＮＡ基因及ｋＤＮＡ进行分析。将新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病患者病变组织及有关利什曼原虫种株，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ，Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ，Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉＸｉｎｊｉａｎｇ“７７１”株，分别抽提各标本的基因组ＤＮＡ和ｋＤＮＡ后，再用相应的引物，Ｒ２２２和Ｒ３３３ＰＣＲ扩增ＳＳＵｒＲＮＡ基因（３９７ｂｐ片段）和１３Ａ、１３Ｂ扩增ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ片段）。ＰＣＲ扩增的ＳＳＵｒＲＮＡ基因（３９７ｂｐ片段）经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后，ＣＬＰ１７病原体的ｓｓＤＮＡ的迁移率与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ者接近，而与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ者亦相差较小。ＰＣＲ扩增的ＣＬＰ１７病原体和Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ）片段，经ＳＳＣＰ分析，ＣＬＰ１７病原体的Ｍｃ１和Ｍｃ２分别为０．８２５９、０．７２２２，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的ＭＦ１和ＭＦ２分别为０．９０７４、０．７９６２。ＭＣ与ＭＦ相比，二者相差较小；ＣＬＰ１７病原体和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ的ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ片段），经ＳＳＣＰ分析，ＣＬＰ１７病原体的ＭＣ１和ＭＣ２分别为?

新疆皮肤利什曼病病原体SSUrRNA基因克隆与序列分析

[目的 ]分析新疆皮肤利什曼病病原体SSUrRNA基因序列 ,为该病原体种株鉴定分析提供实验依据。[方法 ]应用利什曼原虫特异引物R2 2 2及R333,PCR扩增SSUrRNA基因多变区的片段 ,克隆于T Easyvector,并以双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,用DNASIS软件和GenBank微机联网检索分析所测XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列。[结果 ]XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因插入片段长度均为 394bp。XJCLP与L tropicaSSUrRNA基因 394bp序列存在 3个点突变 ,两者有 391个碱基相同 ,相似性为 99 2 %。XJCLP与L infantumSSUrRNA基因序列存在 3个点突变及 1个移码突变 ,两者有 390个碱基相同 ,类似性为99 0 %。L infantum与L tropica的SSUrRNA基因序列存在 1个移码突变 ,相似性为 99 7%。XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列一级结构与RNA二级结构均不同。经用GenBank检索本次所测XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列 ,该GenBank内尚无同类 394bp的SSUrRNA基因序列。[结论 ]XJCLP、L infantum及L tropica的SSUrRNA基因 394bp序列一级结构 ,二级结构存在差异。

杜氏利什曼原虫SSU rRNA逆转录多聚酶链反应的建立

我们采用引物Ｒ２２２和Ｒ３３３建立杜氏利什曼原虫ＳＳＵｒＲＮＡ逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）。采用ＳｉＯ２－高盐吸附法同时抽提杜氏利什曼原虫ＲＮＡ和ＤＮＡ，分别用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ进行扩增，结果显示以ＲＮＡ为检测对象的ＲＴ－ＰＣＲ肉眼可见区带的检测水平较ＬＪＤＮＡ为检测对象的ＰＣＲ扩增高１００倍，可见ＲＴ－ＰＣＲ具有敏感性高、特异性强的特点。

基于SSU rRNA基因的巢氏PCR隐孢子虫系统发育研究

目的鉴定由安徽某地鸭粪便中分离到的隐孢子虫虫种,并完善隐孢子虫DNA提取方法。方法对比液氮反复冻融提取DNA方法及普通DNA提取方法。对由某地区鸭粪便中分离到的隐孢子虫提取DNA,并对其SSU rRNA基因进行巢式PCR扩增,通过序列比对分析和构建系统进化树,解析隐孢子虫的种属关系。结果液氮反复冻融法更易于提取隐孢子虫DNA。该地区鸭粪便感染的隐孢子虫为贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi,C.baileyi)。结论液氮反复冻融提取DNA方法对于检测被隐孢子虫感染的动物粪便切实有效。该地区的鸭存在贝氏隐孢子虫感染,需引起养殖者的重视。

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段，分析其序列特征。方法根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物，采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrRNA基因片段，纯化后与pGEM-Teasy质粒连接，构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，采用BLAST软件分析其特征。结果恶性疟原虫子孢子期SSUrRNA基因扩增片段大小约为347bp；阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段含有347个核苷酸，与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对，其同源性为100％，而与7G8株的同源性则为98．0％，其中第153位碱基发生了缺失，第184位碱基由C取代了T，而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基，第243位碱基则由T取代了c。结论成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSUrRNA编码基因序列，该序列相对保守，不同地理株间存在单核苷酸多态性。

宁夏地区奶牛源隐孢子虫分子鉴定与分析

为了明确宁夏地区奶牛隐孢子虫的流行情况及其优势基因型,采集宁夏4个地区10个规模化奶牛养殖场中1174份奶牛粪便样品,基于核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因通过套式PCR进行检测和分析。结果显示,宁夏地区奶牛隐孢子虫阳性率为28.5%(335/1174);共鉴定出4种虫种,即微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫和安氏隐孢子虫,阳性率分别为40.6%(136/335)、36.1%(121/335)、19.4%(65/335)和3.9%(13/335);微小隐孢子虫共鉴定出4种基因亚型,分别为ⅡdA15G1(n=70)、ⅡdA18G1(n=26)、ⅡdA19G1(n=23)和ⅡdA20G1(n=17)。统计学分析显示,在宁夏地区,0~2月龄的犊牛隐孢子虫感染率最高,且奶牛隐孢子虫的感染率与月龄差异显著相关(P<0.001)。表明宁夏地区奶牛存在隐孢子虫感染且存在人畜共患虫种,ⅡdA15G1微小隐孢子虫是宁夏地区奶牛感染的优势亚型。

玉溪霍尔多巴吉鹅感染贝氏隐孢子虫的分子鉴定

为了对云南省玉溪市某养殖场的霍尔多巴吉鹅进行隐孢子虫检测,本试验采集疑似感染隐孢子虫的霍尔多巴吉鹅的粪便样品,利用饱和盐水漂浮法进行镜检,并结合分子生物学鉴定方法,提取粪便样品DNA,采用巢氏PCR扩增隐孢子虫核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因,测序后通过NCBI进行Blast在线比对,构建系统发育进化树。结果显示,所采集的鹅粪便样品中,隐孢子虫检出率为20.45%(9/44);隐孢子虫SSU rRNA基因的PCR扩增结果显示,该鹅源隐孢子虫与贝氏隐孢子虫同源性达100%;系统进化分析显示,二者位于同一分支。结果表明,该养殖场的霍尔多巴吉鹅存在贝氏隐孢子虫感染。

河北省圈养貉子隐孢子虫流行现状调查

目的:确定河北省圈养貉子隐孢子虫的流行和虫种/基因亚型分布情况。方法:从河北省多地共采集389份新鲜圈养貉子粪便样品,采用基于隐孢子虫核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)基因的巢式PCR方法进行检测,并对获得的隐孢子虫SSU rRNA基因阳性样本进行隐孢子虫60 kDa糖蛋白(gp 60)基因的扩增,对获得的隐孢子虫SSU rRNA和gp 60基因进行测序和分析,并分别在Mega中构建基于这2个基因的进化树(最大似然法),进一步分析所获隐孢子虫的分子特性。结果:基于隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR检测显示,河北省圈养貉子中共检测出6份隐孢子虫阳性样本,隐孢子虫感染率为1.5%(6/389)。其中,6月龄以上貉子的隐孢子虫感染率为1.2%(1/85),6月龄以下貉子的隐孢子虫感染率为1.6%(5/304),二者无显著差异(χ^(2)=0.096,P=0.384)。粪便非正常的貉子隐孢子虫感染率(11.1%,4/36)显著高于粪便正常的貉子(0.6%,2/353)(χ^(2)=23.18,P=0.001)。序列及进化树分析显示,本次从河北省貉子中分离的隐孢子虫虫种均为C.canis,共鉴定出2种基因亚型,即XXa2和XXa4。结论:河北省圈养貉子中存在2种人兽共患的C.canis基因亚型XXa2和XXa4,提示貉子可能成为人隐孢子虫感染的潜在来源。

Detection of two pathogenic marine ciliates Ancistrum haliotis and A. crassum(Ciliophora: Scuticociliatia) by fluorescence in situ hybridization

The scuticociliatid ciliates Ancistrum haliotis and A.crassum are parasites that may cause high mortality in the cultured abalone Haliotis spp.and the bivalve Ruditapes philippinarum.Traditional identification with silver staining methods is hampered by their morphological similarities to closely related species and the complicated procedures of morphological analysis.We designed two SSU rRNA-targeted oligonucleotide probes labeled with a fluorochrome,and optimized the fluorescence in situ hybridization(FISH)protocols for identification of A.halioti and A.crassum,respectively.The assays resulted in a clear identification by strong fluorescence signals from the oligonucleotide probes.The method can be used for quick and accurate quantitative analysis of A.haliotis and A.crassum infections on host molluscs.

广西部分地区猪芽囊原虫的分子流行病学调查和亚型鉴定

目的了解广西部分地区猪芽囊原虫的感染情况和人兽共患特征,以评估人兽共患传播风险。方法本研究采用芽囊原虫小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因常规PCR检测技术对广西贺州、玉林、南宁、贵港、柳州5个地市猪场采集的894份猪粪便样品进行芽囊原虫流行病学调查。结果芽囊原虫总感染率为21.9%(196/894)。在本次调查的地区中,贵港市的感染率最高为37.3%(66/177)、其余依次为玉林市24.1%(35/145)、南宁市20.6%(44/214)、贺州市19.7%(37/188)、柳州市8.2%(14/170)。此外,在不同群体猪中芽囊原虫感染率由高到低依次为仔猪39.5%(96/243)、育肥猪23.1%(52/225)、种猪14.1%(29/205)、保育猪8.6%(19/221)。集约化感染率20.9%(121/580),散户猪群感染率23.9%(75/314)。统计学分析表明,芽囊原虫在不同地区,不同群体猪中感染率差异有统计学意义,在不同养殖方式中感染率差异无统计学意义。在所有阳性样品中共发现ST1、ST5两种人兽共患亚型分别占总阳性率的4.6%(9/196)和95.4%(187/196),表明广西地区猪芽囊原虫存在潜在的人兽共患风险。结论本研究首次对广西5地市猪场芽囊原虫感染情况进行了调查,初步评估了广西地区猪芽囊原虫存在的人兽共患风险,为公共卫生学、猪场生物安全防控提供相关的流行病学参考。

粪便标本溶组织内阿米巴原虫Real-Time PCR检测方法的建立及初步评价

为建立粪便标本溶组织内阿米巴原虫Real-Time PCR检测方法,并评价该方法在临床粪便标本检测中的应用价值,本文基于溶组织内阿米巴原虫小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因序列设计了特异性引物并使用Real-Time PCR方法对溶组织内阿米巴原虫标准株DNA进行扩增,以建立溶组织内阿米巴原虫感染的Real-Time PCR技术。同时收集临床腹泻病人粪便标本221例并分别采用镜检法、Real-Time PCR法和ELISA原虫抗原检测法进行监测,以临床诊断结果为标准,分析3种方法的特异性、敏感性等检测性能。结果表明,本文建立的Real-Time PCR溶组织内阿米巴原虫检测方法特异性好,最低检测限为0.5 fg/μL,可用于临床腹泻患者粪便标本溶组织内阿米巴原虫检测。相对而言,Real-Time PCR方法特异性和敏感性均优于镜检法和ELISA原虫抗原检测法。

宁夏吴忠市羊隐孢子虫感染情况调查及虫种鉴定

为了解宁夏回族自治区吴忠市羊隐孢子虫病流行情况,从吴忠市的2个规模羊场采集480份粪便样品。提取基因组DNA,用套式PCR扩增隐孢子虫SSUrRNA基因,阳性样品进行测序分析。结果显示,吴忠市羊隐孢子虫感染率为28.3%,其中盐池县绵羊感染率为33.8%,同心县山羊感染率为22.9%;共发现3种隐孢子虫感染,其中肖氏隐孢子虫(Cryptosporidium xiaoi)阳性率最高(62.5%),其次是泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)(32.4%),微小隐孢子虫(C.parvum)感染率最低(5.2%);从季节上看,春季感染率最高(49.2%),夏季最低(6.7%);从羊的年龄上看,未断奶羔羊感染率最高(34.4%),而成年羊感染率最低(19.4%);序列比对结果显示,所有阳性样品均在Gen Bank找到100%同源的序列。本研究首次对宁夏羊感染的隐孢子虫进行了分子鉴定,为深入了解宁夏吴忠市羊隐孢子虫病流行情况、制定有效的防控措施提供了依据。

隐孢子虫牛源分离株的分离和鉴定

目的分离和鉴定采自徐州自然感染奶牛粪便中的隐孢子虫卵囊。方法在徐州某奶牛场采集经改良抗酸染色镜检确认为隐孢子虫感染的奶牛粪便,用不连续Sheather’s蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊。采用Chelex-100方法提取卵囊基因组DNA,设计引物扩增小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因和卵囊囊壁蛋白(COWP)基因,分别克隆到pGEM-T和pGEM-T Easy载体,测定核苷酸序列,运用BLAST和MEGA软件进行序列同源性和种系发生分析。结果分离的隐孢子虫卵囊个体大小为(7．4±0．32)μm×(5．4±0．21)μm,长宽比为1．3±0．07(n=20)。徐州牛源隐孢子虫与Gen- Bank公布的安氏隐孢子虫比较,SSU rRNA和COWP基因序列同源性分别为100％和99％。种系发生分析显示该株隐孢子虫与安氏隐孢子虫处于同一分支。结论由徐州自然感染奶牛粪便中分离获得的隐孢子虫是安氏隐孢子虫。

自然感染诺氏疟原虫患者血片样本PCR鉴定

目的对云南省1例诊断为“间日疟”患者血片中形态不典型的疟原虫虫种进行分子生物学鉴定。方法分别抽提待鉴定血片和已知感染虫种的4种疟原虫(间日疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、食蟹猴疟原虫)血片疟原虫基因组DNA,再根据疟原虫小核糖体亚基(SSUrRNA)序列合成疟原虫属特异性引物,以及恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫种特异性引物,然后对包括待鉴定血片在内的疟原虫DNA分别进行PCR鉴定。结果用诺氏疟原虫特异性引物从待鉴定血片DNA中扩增出约150bp条带,测序结果表明该序列与诺氏疟原虫SSUrRNA序列完全一致。结论云南省该例疟疾患者感染了猴疟原虫——诺氏疟原虫。

卵形疟原虫wallikeri亚种及其基因检测体系的研究进展

近年来的研究发现,以核糖体RNA小亚基(SSU rRNA)为标记基因的巢式PCR体系进行检测时,部分镜检卵形疟原虫阳性血样的结果呈阴性,主要原因是卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)的存在。为此本文综述近20年来卵形疟原虫wallikeri亚种的发现和确认的过程,以及在该过程中,开发应用的各种检测卵形疟原虫的方法和体系,为疟疾诊断尤其是卵形疟诊断方面提供技术参考。