利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究

采用16S-23S rDNA间隔区段(IGS)PCR-RFLP与16S rRNA基因部分序列分析的方法对饭豆根瘤菌进行了遗传多样性及系统发育分析.由16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP分析可知,所有菌株在52%的相似性水平上聚在一起,形成了慢生型菌群与快生型菌群这两大菌群.群Ⅰ中,在79%相似性的水平上分为ⅠA与ⅠB两个分支.群Ⅱ中,在62%相似性的水平上分为ⅡA与ⅡB两个分支,分支ⅡA在72%的相似性水平上进一步分为ⅡA1、ⅡA2和ⅡA3三簇;分支ⅡB中的饭豆根瘤菌与标准菌株USDA205T聚在一起,表现的差异并不大.由16SrRNA基因部分序列分析结果可知,供试的4个代表菌株分别位于不同的系统发育分支中.CYR4243与Sinorhizobium fredii的模式菌株USDA205T的序列相似性达到了99.87%.HCY1101与Rhizobium leguminosarum中的三叶草生物型(bv.trifolii)和豌豆生物型(bv.viceae)这两个生物型的参比菌株亲缘关系最近,序列相似性为100%.HCY5202与R.galegae亲缘关系最近,序列相似性为99.86%.CYY3302与Bradyrhizobium elkanii的参比菌株USDA86有最近的亲缘关系,序列相似性近似于100%.

新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体SSU rRNA基因及kDNA的PCR-SSCP分析

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术，对皮肤利什曼病（ＣＬ）病人（Ｐ１７）的病原体ＳＳＵｒＲＮＡ基因及ｋＤＮＡ进行分析。将新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病患者病变组织及有关利什曼原虫种株，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ，Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ，Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉＸｉｎｊｉａｎｇ“７７１”株，分别抽提各标本的基因组ＤＮＡ和ｋＤＮＡ后，再用相应的引物，Ｒ２２２和Ｒ３３３ＰＣＲ扩增ＳＳＵｒＲＮＡ基因（３９７ｂｐ片段）和１３Ａ、１３Ｂ扩增ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ片段）。ＰＣＲ扩增的ＳＳＵｒＲＮＡ基因（３９７ｂｐ片段）经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后，ＣＬＰ１７病原体的ｓｓＤＮＡ的迁移率与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ者接近，而与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ者亦相差较小。ＰＣＲ扩增的ＣＬＰ１７病原体和Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ）片段，经ＳＳＣＰ分析，ＣＬＰ１７病原体的Ｍｃ１和Ｍｃ２分别为０．８２５９、０．７２２２，Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的ＭＦ１和ＭＦ２分别为０．９０７４、０．７９６２。ＭＣ与ＭＦ相比，二者相差较小；ＣＬＰ１７病原体和Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ的ｋＤＮＡ微环（１２０ｂｐ片段），经ＳＳＣＰ分析，ＣＬＰ１７病原体的ＭＣ１和ＭＣ２分别为?

陕西省韩城市利什曼原虫SSU rRNA基因系统发育研究

目的了解陕西省韩城市黑热病区利什曼原虫种类及分子遗传特征。方法对来自韩城市的利什曼原虫阳性标本,进行SSU rRNA基因序列扩增,扩增产物进行测序,与其它不同种类、不同地区利什曼原虫的SSU rRNA基因序列进行比对,分析突变位点规律,建立系统发育树。结果有3份标本SSU rRNA基因序列扩增测序成功,其基因序列与杜氏利什曼原虫、夏科氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的SSU rRNA序列同源性较高,与婴儿利什曼原虫在UQ-II突变区有一个位点的变异,并与新疆荒漠虫株、甘肃省利什曼虫株聚为一类。结论结合流行病学与SSU rRNA序列分析结果,陕西省韩城市黑热病病原体应为婴儿利什曼原虫。

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的 建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。 方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。 结果 C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .

西北太平洋浮游有孔虫的SSU rDNA序列及其古海洋学意义

研究对采集于西北太平洋冲绳海槽表层水体中的活浮游有孔虫进行DNA分析尝试,获得了西北太平洋浮游有孔虫Pulleniatina obliquiloculata和Globigerina sp.等的SSUrDNA序列特征,并与南太平洋地区属种的DNA序列进行对比.结果显示两不同海区P. obliquiloculata个体的SSUrDNA差异与同一个体内不同拷贝序列间差异类似,仅为0.7%-1.2%.详细比较研究认为,传统微体古生物形态学定义种对西北太平洋与南太平洋的P.obliquiloculata来说具有可靠的分子生物学证据.

锥虫Ls-rRNA序列分析与锥虫rDNA探针群

用大分子ＲＮＡ快速测序法测定刚果锥虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）ＬｓｒＲＮＡ５′端６９４个核苷酸序列．比较分析揭示伊氏锥虫、布氏锥虫和刚果锥虫之间以及它们与其它鞭毛虫和哺乳动物宿主的分子差异；表明ＬｓｒＲＮＡ高变区可以作为一个灵敏的分子指标研究锥虫属内的系统进化关系；并为研制属、种不同专一性的锥虫ｒＤＮＡ探针奠定了基础．人工合成锥虫亚属ｒＤＮＡ探针Ｄ１ｔｅ与ＰＣＲ方法联用，可以检测相当于单个伊氏锥虫的微量ＤＮＡ．

基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展

瘤胃微生物是反刍动物与日粮间的纽带。用传统或经典的亨氏滚管法和最大似然法测定瘤胃内微生物总数的结果可能偏低。采用培养方法培养的已知菌种可能不完全适合或进入了未培养状态。由于缺少可行的方法,未知菌种从未培养过。由于任何一个细胞都含核糖体,rRNA/rDNA有进化守恒的特性,建立在16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下,不仅能用于描述分子特性,而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法。基于不同的16S/18S rRNA/rDNA的守恒区能设计出通用、属、种甚至株特异性探针或引物,通过分子杂交能检测、量化细胞含量和测定细胞活性。杂交可得到某个序列或微生物的相对或绝对量。然而,杂交的灵敏度较低,它仅能检测出超过106个细菌/m l瘤胃液。竞争PCR和实时PCR已开发并用于检测瘤胃微生物,其灵敏度达到检测单个细菌。16S/18S rRNA/rDNA方法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可。但是基于16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术不能排斥经典传统微生物方法,但它将成为一项便利技术用于瘤胃微生物研究。

新疆皮肤利什曼病病原体SSUrRNA基因克隆与序列分析

[目的 ]分析新疆皮肤利什曼病病原体SSUrRNA基因序列 ,为该病原体种株鉴定分析提供实验依据。[方法 ]应用利什曼原虫特异引物R2 2 2及R333,PCR扩增SSUrRNA基因多变区的片段 ,克隆于T Easyvector,并以双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,用DNASIS软件和GenBank微机联网检索分析所测XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列。[结果 ]XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因插入片段长度均为 394bp。XJCLP与L tropicaSSUrRNA基因 394bp序列存在 3个点突变 ,两者有 391个碱基相同 ,相似性为 99 2 %。XJCLP与L infantumSSUrRNA基因序列存在 3个点突变及 1个移码突变 ,两者有 390个碱基相同 ,类似性为99 0 %。L infantum与L tropica的SSUrRNA基因序列存在 1个移码突变 ,相似性为 99 7%。XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列一级结构与RNA二级结构均不同。经用GenBank检索本次所测XJCLP、L infantum及L tropicaSSUrRNA基因序列 ,该GenBank内尚无同类 394bp的SSUrRNA基因序列。[结论 ]XJCLP、L infantum及L tropica的SSUrRNA基因 394bp序列一级结构 ,二级结构存在差异。

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的 采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。 方法 采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。 结果 间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。 结论 该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。

杜氏利什曼原虫基因文库的构建及SSU rDNA基因的克隆和筛选

采用新型载体（ＬａｍｂｄａＧＥＭＲ－１１ｖｅｃｔｏｒ系统）完成了杜氏利什曼原虫四川人分离株（简称Ｌ．ｄ．四川人株）的基因组ＤＮＡ大片段克隆。重组噬菌体总数为１．５×１０６。采用地高辛标记的Ｌ．ｄ．四川人株ＳＳＵｒＤＮＡ扩增产物探针筛选文库，获得３个含有Ｌ．ｄ．四川人株ｒＤＮＡ插入片段的重组噬菌体克隆，为今后的亚克隆和ＳＳＵｒＤＮＡ可变区及间隔区结构和功能研究打下了基础。

利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫分子系统发育学

目的利用SSU rRNA分子探讨中国利什曼原虫基因多态性及其分子系统发育学。方法采用PCR法获得中国不同地区利什曼原虫SSU rDNA,通过Clustal X软件比对序列碱基,构建贝叶斯进化树。结果中国不同地区流行利什曼原虫分属于不同的支序,在中国除了有杜氏利什曼原虫外,还有热带利什曼原虫和一支在国际上还没有定种的未定种存在。结论在中国有未定种利什曼原虫存在。

新疆皮肤利什曼病病原体SSU rDNA多变区PCR扩增及克隆

目的鉴定新疆皮肤利什曼病病原体。方法用利什曼原虫属特异引物Ｒ２２２和Ｒ３３３，从皮肤利什曼病患者皮肤病变组织、婴儿利什曼原虫和热带利什曼原虫基因组ＤＮＡ中扩增出一特异ＳＳＵｒＤＮＡ多变区片段，将其克隆到ｐＧＥＭ○Ｒ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ上，并筛选和鉴定出重组质粒。结果以ＥｃｏＲⅠ酶切、ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实获得的重组质粒包含ＳＳＵｒＤＮＡ多变区片段。结论皮肤利什曼病病原体、婴儿利什曼原虫和热带利什曼原虫ＳＳＵｒＤＮＡ多变区片段重组质粒的获得，为进一步序列分析比较提供实验材料。

杜氏利什曼原虫SSU rRNA逆转录多聚酶链反应的建立

我们采用引物Ｒ２２２和Ｒ３３３建立杜氏利什曼原虫ＳＳＵｒＲＮＡ逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）。采用ＳｉＯ２－高盐吸附法同时抽提杜氏利什曼原虫ＲＮＡ和ＤＮＡ，分别用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ进行扩增，结果显示以ＲＮＡ为检测对象的ＲＴ－ＰＣＲ肉眼可见区带的检测水平较ＬＪＤＮＡ为检测对象的ＰＣＲ扩增高１００倍，可见ＲＴ－ＰＣＲ具有敏感性高、特异性强的特点。

基于SSU rDNA和线粒体cox 1序列分析甲藻中不同生态类群的演化规律

应用SSU rDNA和线粒体cox 1序列研究甲藻(Dinoflagellate)中不同生态类群的演化关系。通过PCR扩增和测序获取4株甲藻SSU rDNA及其线粒体cox 1部分片段,结合GenBank中24株甲藻的相关序列,以Plasmodium falciparum为外群,构建ML树和NJ树,并采用自展支持度评估进化树分支结构,通过计算后验概率评估进化树整体结构,应用1sKH、SH、ELW和2sKH等方法评估两株ML树间的拓扑结构。结果显示,在由上述两序列构建的进化树上,底栖原甲藻均未与浮游原甲藻聚类,且前沟藻具有独特演化地位。表明联合选择SSU rDNA和线粒体cox 1序列构建的进化树在一定程度上能够反映出甲藻的演化规律。这为从基因层面深入探索甲藻中不同生态类群的演化关系初步奠定了基础。

裳卷蛾变形孢虫SSU rRNA核心序列的克隆与系统发育分析

【目的】利用分子生物学手段探索裳卷蛾变形孢虫的遗传发育地位。【方法】微孢子虫的SSUr RNA序列是构建系统发育进化树的重要工具。试验通过T-A克隆法对裳卷蛾变形孢虫(Vairimorpha ceraces)SSU rRNA核心序列进行了克隆,并采用近邻法构建了系统发育进化树。【结果】克隆得到了长为1228bp的核苷酸序列(GenBank EU267796)。系统发育分析结果表明:裳卷蛾变形孢虫与分离于小菜蛾(Plutella xylostella)的Vairimorpha sp.Germany(GenBank AF124331)和Vairimorpha imperfecta(GenBank AJ131645)相似性最高,它们在系统发育进化树中与寄主为鳞翅目昆虫的Nosema属聚为一类,与纳卡变形孢虫(Vairimorpha necatrix)为代表的Vairimorpha属为相邻集。【结论】结合其生物学特征,裳卷蛾变形孢虫确实为Vairimorph a属的成员,但根据系统发育分析归入Nosematidae科可能更为合适。

rRNA基因(rDNA)序列分析在中药品种鉴定中的应用及研究进展

rRNA基因 (rDNA)序列分析方法用于植物系统分类与进化研究有较高的可靠性。近年来中药品种的鉴定也越来越多地使用DNA指纹标记 (如RAPD、RFLP、AFLP、SSR、ISSR、SSLP等 )和DNA序列测定。通过详述DNA序列测定中核基因组的rRNA基因 (rDNA)方法和 2 0 0 0年以来在中药鉴定中的应用 ,认为高等植物rRNA基因上的 18SrDNA、ITS及 5SrDNA片段常具有变异位点 。

新疆地区皮肤利什曼病病原体SSU rDNA PCR扩增及限制性酶切分析

我们采用引物R200和R300，对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（CL）患者的皮肤病变组织内抽提的微量利什曼原虫SSUrDNA，以及有关利什县原虫种株的SSUrDNA进行PCR扩增，然后分别采用限制住内切酶Rsal和Hhal对PCR扩增产物进行限制性酶切分析。结果显示：采用RsaⅠ进行限制性酶切分析，克拉玛依地区2例CL患者皮肤病变组织标本的PCR扩增产物经酶切后，其电泳图形与L．tropica完全相同。显示克拉玛依地区CL病原体SSUrDNA的PCR扩增产物与L．tropica存在相同的限制性内切酶图谱。

山西省及周边地区利什曼原虫SSU rRNA基因和ITS-1序列克隆及序列系统进化分析

为了解山西及周边地区内脏利什曼病的病原体利什曼原虫(Leishmania spp.)的虫种类型及其基因多态性,使用首都医科大学附属北京友谊医院收治的13例来自山西及周边地区的内脏利什曼病患者的骨髓样本提取DNA,分别扩增其核糖体小亚基rRNA(small subunit ribosomal RNA,SSU rRNA)和核糖体DNA内转录间隔区Ⅰ(ITS-1)并应用其序列构建系统发育树确定患者感染原虫的虫种类型及其遗传关系。结果显示,13个临床样本SSU rRNA和ITS-1序列同源性分别为99.59%和99.93%。基于SSU rRNA构建的系统发育树显示13个患者感染的虫种与杜氏利什曼原虫L.donovani、婴儿利什曼原虫L.infantum和恰氏利什曼原虫L.chagasi聚为一支。基于ITS-1构建的系统发育树显示13例患者感染的利什曼原虫均属于婴儿利什曼原虫。SSU rRNA与ITS-1序列分类的结果一致,ITS-1在利什曼原虫虫种鉴定上较SSU rRNA分辨率高,可鉴定到亚种水平。13例山西及周边地区利什曼病患者感染原虫均为婴儿利什曼原虫L.infantum,感染虫株间同源性较高。

18S rRNA/rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类学研究中的应用

作者指出了反刍动物瘤胃原虫分类学研究中的难点,介绍了原虫分类学中新兴的分子生物学指标(18S rRNA/rDNA序列同源性),综述了18S rRNA/rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类研究中的应用。

基于SSU rDNA序列的网状车轮虫群体遗传结构及多样性研究

基于SSU rDNA序列对当前分布于我国的网状车轮虫(Trichodina reticulata Hirschman&Partsch,1955)的群体遗传结构与多样性进行了研究。遗传结构研究结果表明:20个样本共检测到9个单倍型,含4个共享单倍型与5个特有单倍型,其中鲫来源的Hap3是最大的共享单倍型;草鱼来源的Hap8和小黄黝鱼来源的Hap9暂被视为湖北武汉和西藏地区各自特有的单倍型;同时推测鲫来源的单倍型Hap1为祖先单倍型。结合ML系统发育树分析推测,在多宿主的进化历程中,鲫寄生的网状车轮虫可能是分化最早的群体,且草鱼寄生的网状车轮虫在起源上来自于鲫。遗传多样性结果显示,所有群体均呈现较高的单倍型多样性(Hd≥0.5)与较低的核苷酸多样性(P_(i)<0.005),且鲫来源的单倍型多样性显著高于草鱼来源,但核苷酸多样性(P_(i))明显低于后者。遗传分化(F_(st))与基因流(N_(m))研究结果表明,Group A(鲫来源)与Group B(草鱼来源)群体间相对独立且已经达到了极度分化程度,群体内基因层面的交流较少。综合中性检验与核苷酸单倍型错配分析认为,Group A(鲫来源)未发生过种群扩张,Group B(草鱼来源)则存在过早期的种群扩张历史。