SSU1多拷贝表达对酿酒酵母二氧化硫生成量的影响

【目的】在不影响酵母正常代谢前提下,构建亚硫酸盐分泌量提高的基因工程菌株,增加二氧化硫生成量,有效地解决啤酒老化问题。【方法】以适量高产二氧化硫工业啤酒酵母突变株M8总DNA为模板,PCR方法得到带有不同长度5′端非编码区的基因片段SSU1-1、SSU1-2,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352构建表达载体pSU1和pSU2,转化实验室酵母YS58,验证SSU1多克隆表达对其二氧化硫生成量的影响。进而将pSU2转化工业啤酒酵母M8,利用亚硫酸盐抗性筛选转化子,并对其二氧化硫和硫化氢生成量及其啤酒抗老化性能进行测定和分析。【结果】实验室酵母转化子pSU1-4和pSU2-3二氧化硫生成量较原株明显提高而硫化氢生成量基本不变,工业啤酒酵母转化子Y2二氧化硫生成量比原株M8提高74.4%,TBA值下降14.9%,DPPH自由基清除率提高38.2%,硫化氢生成量基本不变。【结论】SSU1基因的多拷贝表达有效提高了亚硫酸盐转运蛋白Ssu1p表达量,增加了亚硫酸盐分泌量,啤酒抗氧化能力得到明显增强,而对酵母硫代谢途径中亚硫酸盐还原为硫化物代谢过程没有影响。

酿酒酵母中亚硫酸盐转运基因SSU1的分子进化分析

SSU1基因是涉及亚硫酸外排及SO2耐受性的重要因素之一。为了研究酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)中SSU1对SO2耐受性及其分化机制,文章探讨了SSU1基因在酿酒酵母中的遗传特征及进化规律。基于SSU1基因序列的聚类分析表明,酿酒酵母群体可通过该基因分为3个亚群,且与其分离的地理位置无关;基于群体数据的McDonald-Kreitman检验表明,SSU1基因在酿酒酵母中受到适应性选择的作用;Ka/Ks检验表明,在酿酒酵母中,不同的亚群间有Ka/Ks显著大于1的值,且PAML的支系模型检验到正选择作用在群体中特定的支系上;PAML的支系-位点模型检验获得9个潜在正选择作用位点,其中有4个发生在受正选择作用的特定支系中;基于ssu1p蛋白结构的分析表明,在特定支系存在的正选择作用位点中,除345(R/K)位点上两氨基酸替换均为碱性氨基酸外,其他3个位点均是极性氨基酸/疏水性氨基酸之间替换,考虑不同区域的氨基酸pKa值对其维持正常的功能有着重要的作用,在该类位点的替换可能影响到ssu1p蛋白对SO2的转运作用。

高水平表达SSU1的酿酒酵母菌构建

通过构建亚硫酸盐转运蛋白(SSU1)基因重组表达载体,获取能够高效表达SSU1基因的酵母工程菌株。根据酿酒酵母SSU1基因序列设计引物,以提取的酿酒酵母AH109基因组DNA为模板,PCR扩增获得SSU1基因片段,克隆至酵母表达载体JMB440的Bam HⅠ和XhoⅠ位点,然后经过菌落PCR、Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切和DNA测序鉴定,成功构建重组质粒JMB440-SSU1。将重组质粒转化至酿酒酵母AH109,经营养缺陷培养基筛选后获得阳性克隆并发酵培养,通过SDS-PAGE电泳检测SSU1蛋白在重组酵母菌株中的表达。结果表明成功构建了高效表达SSU1的重组酿酒酵母菌株。

贝酵母SSU1基因的克隆与分析

目的:克隆贝酵母SSU1基因,对其进行序列分析。方法:采用PCR技术首次在贝酵母基因组DNA中对SSU1基因序列进行全长克隆,用NCBI、ExPASy等网络数据库和ANTHEPROT等分子生物学软件分析其序列,对其功能进行预测,建立基于SSU1同源基因的系统发育树,对其分子进化进行分析。结果:克隆得到贝酵母SSU1基因,全长872 bp,包含1个387 bp的开放阅读框,编码126个氨基酸,其疏水性大于亲水性。编码的蛋白质不存在信号肽及卷曲螺旋结构,而含有跨膜区域。该蛋白为单链蛋白,主要由无规则卷曲和α-螺旋构成。基因编码的蛋白含有1个亚硫酸盐敏感蛋白SSU1及其运载体蛋白酶的TDT家族和1个TehA功能域。贝酵母与巴斯德酵母遗传关系较近。结论:贝酵母SSU1基因编码的质膜蛋白为疏水性转运蛋白,具有调节亚硫酸盐代谢的功能,是酿酒酵母中1个重要的亚硫酸盐调控基因。

基于S7-1500PLC的上下料冲压控制系统的设计与实现

针对工业中普遍使用的零部件冲压工艺,使用西门子新型S7-1500PLC作为控制器,通过博途V14软件进行PROFINET通讯组态,连接通用型G120变频器和具有安全扭矩停止功能的V90伺服系统,分别完成物料的高低速传送、工件滑台的准确定位和左右运动,结合电感应传感器和气缸,实现自动上下料和工件冲压功能,并且使冲压工件尺寸误差控制在±0.5 mm以内;同时,使用精简型TP700HMI,实现了整个系统的可视化监控操作。