间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段,分析其分子特征,评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物,采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定分析其序列特征;以SSUrDNA为靶基因,建立间日疟PCR诊断方法,并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。结果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有267个核苷酸,与间日疟原虫Sal1株孢子期SSUrRNA基因序列比较,同源性为99·3%,其中第220位为插入了1个碱基“T”,243位碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板,PCR扩增结果显示检测灵敏度至少达102copy/μl;特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段,而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准,PCR敏感性为100%(102/102),特异性为100%(76/76)。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定,不同地理株间存在单核苷酸多态性,以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异,具有良好的推广使用价值。

九种微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)基因拷贝数的研究

以已克隆测序的家蚕微孢子虫 (镇江株 ,Nosemabombycis)的核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因(12 0 5bp)为模板 ,用随机引物合成法标记的探针 ,在与 9种微孢子虫及家蚕基因组DNA的 6种限制性内切酶的酶切产物的Southern杂交图谱中 ,9种微孢子虫基因组DNA酶切产物的杂交图谱极为相似 ,而与家蚕基因组DNA的任何一种酶的酶切产物均无杂交信号 ,表明微孢子虫和家蚕的SSUrRNA基因同源性很低或没有同源性。同时还证实了已克隆的SSUrRNA基因来源于微孢子虫基因组DNA ,不是从家蚕基因组DNA扩增而来。在酶解较为完全的酶切产物的杂交图谱中 ,微孢子虫基因组DNA中SSUrRNA基因的拷贝数至少在

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段,并进行序列分析。 方法 根据文献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段,纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子,并导入大肠杆菌JM1019;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。 结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp;阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段;测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比,未发现碱基的插入或缺失去,同源性为99.3％;第353位碱基由C取代了G,第371位碱基由T取代了c,其余序列相同。 结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段,该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。

家蚕微粒子病原虫(Nosema bombycis)小亚基核糖体RNA全基因的克隆及其二级结构的构建

在用PCR技术扩增、克隆、测序了家蚕微粒子病原虫Nosemabombycis (镇江株 )小亚基核糖体RNA基因核心序列(5′ 端起 12 0 0bp)的基础上 ,用SSP PCR技术克隆了核心序列 3′ 端下游序列 ,从而获得了家蚕微粒子病原虫小亚基核糖体RNA基因的全序列共 12 33bp。用RnaViz、Forcon、DCSE等生物软件构建了家蚕微粒子病原虫小亚基核糖体RNA的二级结构 ,与其它微孢子虫及真核生物小亚基核糖体RNA的二级结构相比 ,该二级结构缺乏螺旋 10、E10 1、 11、 18、E2 3 n和43。

安徽省部分地区猪贾第虫PCR检测及阳性株的分子特性

为了解安徽省规模化猪场贾第虫感染情况及分子特性,从安徽省多地共采集500份新鲜猪粪样,提取基因组DNA,首先采用基于蓝氏贾第虫SSUrRNA基因套式PCR对所有粪便进行检测,并对获得的阳性样本分别基于贾第虫TPI和GDH基因的PCR扩增,然后对获得的PCR产物进行测序和分析,确定贾第虫的聚集体。结果显示,500份猪粪便样品中,SSUrRNA基因套式PCR仅在利辛猪场检测出1例贾第虫阳性样本,猪贾第虫阳性率为0.20%。TPI和GDH基因的测序分析显示该贾第虫基因型为聚集体E。

长春地区兔的隐孢子虫分子流行病学调查

为了对长春地区家兔的隐孢子虫感染情况进行分子流行病学调查,试验针对隐孢子虫基因中核糖体小亚基RNA（SSUrRNA）保守序列分别设计两对引物进行PCR扩增,建立检测家兔的隐孢子虫的巢式PCR方法,并对长春不同地区3个兔场149份家兔粪便样品进行流行病学调查。结果表明：本试验成功建立了兔隐孢子虫巢式PCR方法,特异性扩增出了大小为1 325 bp和830 bp的目的片段,利用建立的PCR方法检测出8份阳性样品,阳性率为5.37%,其中1份为微小隐孢子虫（C.parvum）,7份为兔隐孢子虫（C.cuniculus）。说明建立的巢式PCR方法具有较高的灵敏性和特异性,适合于临床应用,同时发现长春地区兔隐孢子虫感染存在人兽共患虫种。

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸(SSUrRNA)编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。

从梨花迁粉蝶中所得微孢子虫的系统进化分析

从中国云南省野外采集的梨花迁粉蝶(Catopsilia pyranthe)中分离得到一株疑似微孢子虫,对该分离株的核糖体SSUrRNA(Small subunit ribosomal RNA)和α-tubulin基因进行克隆测序。通过序列分析及系统进化树构建,结果发现该分离株属于Nosema属的一种微孢子虫,命名为Nosema sp.CP。通过对SSUrRNA系统进化分析发现,Nosema sp.CP与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、斜纹夜蛾微孢子虫(Nosema spodopterae)的亲缘关系相对于菜粉蝶微孢子虫Nosema sp.MPr更加接近。通过对α-tubulin基因的系统进化分析,结果表明Nosema sp.CP与N.bombycis聚在一支上,进一步证实了它们的紧密关系。因此,本研究首次在粉蝶科(Pieridae)的梨花迁粉蝶中分离得到的Nosema属微孢子虫是与家蚕微孢子虫非常近源的一类微孢子虫,并暗示了粉蝶科昆虫感染的微孢子虫具有潜在多样性。