大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定

采用PCR技术,从大肠杆菌K99中扩增出0.54kb的K99菌毛抗原基因,然后将其克隆到pUCm-T载体上,用BglⅡ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,通过T4连接酶与同样经BamHⅠ和SalⅠ双酶切合成的耐热肠毒素STⅠ核苷酸序列连接,通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析,证明插入的K99-STⅠ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STⅠ肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫（21～40表位肽）及体液免疫（141～160表位肽）相关的基因序列2020VP1，运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STⅠ基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STⅠ，转化宿主菌BL21（DE3）RIL后的表达产物经SDS—PAGE分析，结果显示重组融合蛋白的分子量约为45kDa，表达量较高。ELISA实验结果显示，融合蛋白能与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异结合。动物实验表明，融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体，免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应；同时，融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击，免疫兔体能够产生STⅠ中和抗体，且融合蛋白不具STⅠ毒性，证明融合蛋白具有良好的LTB、STⅠ免疫原性。实验结果表明，此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值。

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STⅠ和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌 (EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因 ,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体 ,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析 ,结果表明 ,插入片段LTB_STⅡ_STⅠ的核苷酸序列与预期一致 ,且阅读框正确。pBST在宿主菌BL2 1(DE3 )RIL中的表达产物经SDS_PAGE初步分析 ,显示重组融合蛋白的分子量约为 40kD ,其表达量约占菌体总蛋白的 46 %。

ST6GalⅠ抑制TNFR1表达调控肾透明细胞癌凋亡

目的探讨ST6GalⅠ对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法qRT-PCR和Western blot检测ST6GalⅠ和TNFR1在肾透明细胞癌细胞中的表达。构建ST6GalⅠ差异表达肾透明细胞癌细胞株,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平,并分析ST6GalⅠ和TNFR1表达的相关性,qRT-PCR和Western blot检测差异表达ST6GalⅠ细胞中TNFR1的表达,采用流式细胞术检测同时差异表达ST6GalⅠ和TNFR1的A498和Caki-1细胞的凋亡水平。结果与ST6GalⅠ在5种肾透明细胞癌细胞中均高表达(P<0.05);抑制ST6GalⅠ表达后A498细胞凋亡率升高(P<0.01),Caki-1细胞过表达ST6GalⅠ后细胞凋亡率降低(P<0.001)。TNFR1 mRNA和蛋白在5种肾透明细胞癌细胞株中均低表达,且与ST6GalⅠm RNA和蛋白表达呈负相关(r=-0.9667,-0.9928,均P<0.01);抑制ST6GalⅠ表达TNFR1表达增加(P<0.001),而ST6GalⅠ过表达TNFR1表达降低(P<0.001);A498细胞同时抑制ST6GalⅠ和TNFR1表达后细胞凋亡率低于单独抑制ST6GalⅠ(P<0.01),Caki-1细胞同时过表达ST6GalⅠ和TNFR1后细胞凋亡率高于单独抑制ST6GalⅠ(P<0.01)。结论ST6GalⅠ可通过抑制TNFR1表达而抑制肾透明细胞癌的凋亡。

SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达

为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。

ST6GalⅠ在肾透明细胞癌中的表达及其对患者预后的影响

目的探讨人β半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶Ⅰ(ST6GalⅠ)在肾透明细胞癌(ccRCC)癌组织及正常肾组织中表达的差异及其对患者预后的影响。方法以2013年1月-2019年12月来本院就诊的ccRCC患者127例为研究对象。应用qRT-PCR方法检测癌组织及同一患者正常肾脏组织中的ST6GalⅠ表达。分析ST6GalⅠ在癌组织及正常肾脏组织中的表达水平的差异,并收集患者的临床资料,对纳入研究患者通过电话、门诊、住院等方式进行随访患者生存情况。采用Kaplan-Meier生存分析法计算患者生存率。采用Cox比例回归风险模型分析影响患者预后的因素。结果qRTPCR结果显示,纳入研究的患者癌组织中ST6GalⅠ的表达水平显著高于同一患者正常肾脏组织,差异具有统计学意义(P<0.05);经Kaplan-Meier法分析结果显示,ST6GalⅠ高表达、组织类型为中低分化、肿瘤直径>7 cm,临床分期为Ⅱ期是影响患者生存的因素。经多因素Cox回归分析结果显示,ST6GalⅠ高表达、组织类型为中低分化、肿瘤直径>7 cm、临床分期为Ⅱ期是影响患者预后的独立危险因素。结论ST6GalⅠ在癌组织中的表达水平显著高于正常肾脏组织,且ST6GalⅠ高表达是患者预后的独立危险因素,同时组织分级为中低分化、肿瘤直径>7 cm、临床分期为Ⅱ期也是患者预后不良的独立危险因素。

稳定表达鸡ST3GALⅠ基因BHK-21细胞株的建立

筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21细胞后,ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达,经G418抗性和RT-PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒按不同比例接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和空白BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组以检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒的增殖效果。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。通过在BHK-21细胞中稳定表达ST3GalⅠ基因,提高BHK-21细胞表面SAα-2,3Gal受体丰度连续传6代后仍然能检测到其表达,荧光显微镜下能看到绿色荧光,RT-PCR可检出1 029bp的目的条带。结果显示,BHK-21-ST3GalⅠ细胞在接毒量为2%时HA滴度达到1∶256,显著高于空白BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。

瑞舒伐他汀减轻ApoE^(-/-)小鼠动脉硬化形成与ST6Gal-Ⅰ表达相关性研究

目的研究瑞舒伐他汀减轻ApoE^(-/-)小鼠动脉硬化形成与ST6Gal-Ⅰ表达相关性,为动脉硬化治疗提供理论依据。方法选取46只ApoE^(-/-)小鼠为研究对象,随机分为对照组和研究组,每组23只。对照组采用高胆固醇饲料,研究组采用高胆固醇饲料且行瑞舒伐他汀灌胃,观察2组小鼠血脂指标、斑块面积及主动脉内膜厚度及ST6Gal-Ⅰ的表达。结果研究组血脂水平均低于对照组(P<0.01);研究组斑块面积及主动脉内膜厚度,均小于对照组(P<0.01);对照组ST6Gal-Ⅰ表达逐渐下降,研究组ST6Gal-Ⅰ表达逐渐提高。结论瑞舒伐他汀与ST6Gal-Ⅰ的表达存在正相关,且对小鼠动脉粥样硬化的治疗具有重要的临床价值。

何首乌水溶性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡糖苷(STI)对内皮细胞表达VEGF的影响

目的 研究何首乌水溶性成分 2 ,3,5 ,4′ 四羟基二苯乙烯 2 O β D葡糖苷 (STI)对溶血磷脂酰胆碱 (LPC)诱导人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。方法 在ECV30 4细胞培养基中加入LPC(2 5mg·L- 1 )或LPC与STI共孵 2 4h ,收集各组条件培养基 ,用基础酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测各组条件培养基中VEGF蛋白含量 ;用原位杂交法、RT PCR及RealtimeRT PCR法检测LPC对内皮细胞VEGFmRNA的表达及STI的影响。结果 ECV30 4细胞暴露于LPC后 ,VEGF蛋白分泌明显增加 ;加入STI后VEGF蛋白含量明显降低 ;LPC可以使ECV30 4中VEGFmRNA的表达明显升高 ,并使VEGF1 6 5mRNA的表达升高 ;STI可剂量依赖性地抑制VEGF1 6 5mRNA的高表达。结论 LPC能诱导ECV30 4细胞表达高水平的VEGF蛋白及VEGFmRNA ,1× 1 0 - 5mol·L- 1STI可抑制LPC的作用 ,降低VEGF的高表达。

硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基转移酶Ⅰ研究进展

肝素/硫酸乙酰肝素是目前临床运用最广泛的抗凝血与抗血栓类药物。硫酸乙酰肝素3-O-硫酸磺基转移酶Ⅰ(Hs3stⅠ)是肝素/硫酸乙酰肝素酶化学法合成中的关键酶,可以催化硫酸基团转移到葡萄糖胺C3的羟基位置,从而形成重要的抗凝血结构单元。总结了近年来Hs3stⅠ的酶学特性、外源表达以及应用等方面的研究进展。

α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响

目的 研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2 ,6唾液酸转移酶 (ST6GalI)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响 .方法 结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6GalIcDNA或反义ST6GalIcDNA的部分序列的表达载体pcDNA3 .1,以RT -PCR检测转染子ST6GalImRNA的表达 ,流式细胞仪检测细胞表面α2 ,6唾液酸含量 .结果 转染正义ST6GalIcDNA的克隆显示ST6GalImRNA的表达增强以及接骨木凝集素 (SNA)与细胞表面成分的结合增加 ;而转染反义ST6GalIcDNA的部分序列的细胞克隆的ST6GalImRNA的表达减少 ,SNA与细胞表面成分的结合力降低 .结论 ST6GalI的表达直接影响细胞表面α2 ,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能 .利用反义核酸技术抑制ST6GalI的表达并降低肿瘤细胞表面α2 。

肌钙蛋白及心电图对非ST段抬高急性冠脉综合征患者预后预测的意义

目的评估肌钙蛋白测定及心电图变化对非ST段抬高急性冠脉综合征患者预后预测的价值。方法收集资料完整的非ST段抬高的急性冠状动脉综合征患者238例,入院后即刻行12导联心电图检查及抽取静脉血做血清肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)检测,并根据心电图变化及TnⅠ水平分组,观察各组住院期间主要心血管事件,并随访1个月￣6个月。结果ST段压低组的反复心绞痛发作及复合心血管事件较正常心电图组明显增多。所有非ST段抬高心肌梗死及31.9%不稳定性心绞痛患者的TnⅠ阳性,TnⅠ阳性组有明确冠心病诊断者较TnⅠ阴性组多,非致命性心肌梗死发生率增高,反复心绞痛发作增加,心血管事件增多。对复合心血管事件的预测,TnⅠ阳性因素较ST段压低因素的敏感性高(P<0.01)。多因素Logistic回归分析显示,TnⅠ阳性较ST段压低因素对患者复合心血管事件有较高的独立预测价值。结论肌钙蛋白测定及心电图变化对非ST段抬高的急性冠脉综合征患者预后预测具有重要意义,而且TnⅠ阳性因素可能具有更高的独立预测性。

ETEC肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

肠毒素性大肠杆菌的致病性与其具有粘附性的菌毛和产肠毒素的能力密切相关。由于菌毛的血清型多而复杂 ,肠毒素只有不耐热肠毒素 (LT)和耐热肠毒素 (ST)两种 ,因此成为研究的对象。用三对扩增产物分别为 1 1 0bp、2 37bp、368bp的引物建立了检测LT和STⅠ、STⅡ毒素基因的多重PCR方法。扩增产物分别用HindⅢ、HincⅡ、Sau3AⅠ限制性内切酶酶切 ,均得与预期一致的 2个片段。对各个参考株的检测结果为 1 0 0 %符合。结果表明该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性。

大肠杆菌pSLM_(004)质粒的酶切分析及其肠毒素ST_Ⅰ基因探针的制备

利用硷变性及羟基磷灰石柱层析法提纯了大肠杆菌pSLM004质粒,经酶切分析证实了耐热肠毒素(STⅠ)基因片段在pSLM004中的定位,并成功地分离回收了STⅠ基因片段;采用随机引物法对STⅠ基因片段进行了α-32P标记,成功地制备了STⅠ基因探针,菌落杂交效果良好。

ST6GalⅠ在肾透明细胞癌中表达及其与病理特征的关系

目的探讨人β半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶Ⅰ(ST6GalⅠ)在肾透明细胞癌(ccRCC)组织及正常肾组织中表达的差异及其与患者病理特征的关系。方法选择2013年1月~2019年12月来院就诊的ccRCC患者127例作为研究对象,取ccRCC患者癌组织作为研究组,癌旁正常肾组织作为对照组。免疫组化法检测两组ST6GalⅠ的表达,分析其表达与年龄、性别、肿瘤大小、分期及肿瘤分级的关系。结果免疫组化结果显示,研究组ST6GalⅠ表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同年龄、性别的ccRCC组织中ST6GalⅠ的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同肿瘤分期、大小、分级的ccRCC组织中ST6GalⅠ的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ST6GalⅠ在ccRCC组织中的表达水平高于正常肾脏组织,且肿瘤大小≥7 cm,分期为2期,分级为中低分化的ccRCC患者ST6GalⅠ表达阳性率也较高。

稳定表达鸡ST3GalⅠ的BHK-21细胞株的构建及禽流感病毒的增殖

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达载体pcDNA3.1-EGFP中构建真核表达质粒,转染BHK-21细胞后,通过G418抗性和绿色荧光蛋白标记双重筛选,鉴定1株表达ST3GalⅠ阳性的单克隆细胞株,绿色荧光丰富。经流式细胞仪检测,BHK-21-ST3GalⅠ细胞株中α-2,3连接型受体丰度较亲代BHK-21细胞显著提高。连续传5代10代后仍能检测到其表达,表明ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达。为了检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒的增殖效果,将H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。试验结果表明,BHK-21-ST3GalⅠ细胞中禽流感病毒的HA滴度达到1∶256,显著高于BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。

α-2、3唾液酸转移酶Ⅰ对前列腺癌细胞系PC3生物学行为的影响

目的探讨α-2,3唾液酸转移酶Ⅰ(ST3Gal-Ⅰ)对PC3生物学行为的影响。方法将前列腺癌细胞系PC3分为空白对照组、阴性对照组、干预组。空白对照组不作任何处理,阴性对照组转染pEGFP-N1质粒,干预组转染pEGFP-N1-ST3Gal-Ⅰ质粒。采用Western blot检测三组中ST3Gal-Ⅰ蛋白表达量,采用CCK8法检测三组PC3增殖率,通过Transwell小室侵袭实验检测三组PC3侵袭能力,采用流式细胞术检测三组PC3凋亡率。结果干预组PC3增殖率、侵袭能力及ST3Gal-Ⅰ蛋白表达量明显高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05);干预组PC3凋亡率明显低于空白对照组、阴性对照组(P<0.001);阴性对照组PC3增殖率、侵袭能力、凋亡率及T3Gal-I蛋白表达量与空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 ST3Gal-Ⅰ能够促进PC3增殖、侵袭,抑制其凋亡。

适应H_9亚型禽流感病毒增殖的重组R-MDCK细胞系的建立

克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。