拟穴青蟹STEAP4-like基因的克隆与表达分析

为了解拟穴青蟹(Scylla paramamosain)前列腺6跨膜上皮抗原4基因(six-transmembrane protein of prostate 4,STEAP4)在拟穴青蟹抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)免疫应答中的作用,表达与纯化GST-STEAP4重组蛋白,(1)通过聚合酶链式反应(PCR)克隆了STEAP4基因,利用生物信息学分析软件分析其序列特征;(2)通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其组织分布及WSSV感染后的表达情况;(3)构建原核表达载体pGEX-6p-1-STEAP4-like,诱导表达与纯化重组蛋白GST-STEAP4-like。结果表明:(1)拟穴青蟹STEAP4-like基因ORF长1443 bp,编码480个氨基酸,N端含有NAD结合位点和一个NADP氧化还原酶辅酶结构域,C端含有一个铁还原酶跨膜结构域;(2)氨基酸序列与三疣梭子蟹STEAP4-like相似性最高,与三疣梭子蟹和突眼蟹亲缘关系最接近;(3)STEAP4-like基因在被检测组织中均有表达;(4)WSSV刺激后STEAP4-like基因显著性下调表达。综上,STEAP4-like可能在拟穴青蟹抗病毒侵染免疫反应中具有重要作用。

SOCS3、STEAP4、MK2和ZFP36基因间及基因-环境交互作用与新疆维吾尔族人群高血压的关联研究

目的研究SOCS3、STEAP4、MK2和ZFP36基因间及基因一环境交互作用与新疆维吾尔族人群高血压的相关性。方法采取以流行病学调查为基础的病例对照研究，选取872例维吾尔族自然人群（高血压组399例，正常对照组473例）作为研究对象。首先对STEAP4、MK2及ZFP36进行测序筛查维吾尔族高血压患者的基因变异位点，然后选择出代表性变异位点，而SOCS3基因则是查阅文献后直接选择代表性的标签SNPs，之后应用TaqMan-PCR基因型鉴定和病例对照研究，并结合多因子降维法（multifactordimentionalityreduction，MDR）分析基因一基因、基因一环境的交互作用。结果4个基因的10个TagSNPs变异位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P〉0．05）。在高血压及对照组中SOCS3基因rs9914220位点及STEAP4基因rs8122位点基因型频率分布有差异（X2=7．07，P=0．029；矿=8．631，P=0．013）。单体型分析发现SOCS3基因H4G-C-A在对照组的频率高于高血压组（10．47％VS6．58％％），差异有统计学意义（P=0．006）。MDR结果显示，在所有模型中，SOCS3rs9914220基因和超重肥胖交互作用检验准确性最高，为61．58％，交叉验证一致性为10／10，P=0．001。应用Logistic回归分析校正性别、年龄、空腹血糖、TC、TG等影响因素后显示，SOCS3基因rs9914220（CC＋CT）合并BMI作用增加新疆维吾尔族人群高血压发生风险（OR=1．025，95％CI：1．002-1．049，P=0．033）。结论SOCS3基因rs9914220（CC＋CT）合并超重肥胖时可能进一步增加新疆维吾尔族人群高血压的风险。

STEAP4基因多态性与新疆维吾尔族人群超重及肥胖的相关性研究

目的探究前列腺六次跨膜上皮抗原4(STEAP4)基因多态性是否与新疆维吾尔族人群的超重及肥胖相关。方法研究对象来自一项关于新疆和田地区维吾尔族人肥胖等代谢性疾病的横断面调查研究。收集他们的一般资料(性别、年龄、身高、体重、BMI、血压水平及血液标本进行肝肾功离子、血脂、血糖、胰岛素等指标测定。按照BMI水平进行分组:BMI<25 kg/m^2为非肥胖组(893例);BMI≥25 kg/m^2为超重及肥胖组(1155例)。采用TaqMan-PCR方法对两组人群的STEAP4基因的3个基因多态性位点(rs8122、rs34741656、rs1981529)进行基因型鉴定。结果STEAP4基因的rs1981529的基因型(TT,TC,CC)和等位基因(T,C)在两组之间均存在统计学差异(P<0.001)。CC基因型频率在非肥胖组高于超重及肥胖组(4.4%vs 2.0%)。rs8122基因型(AA、AG、GG)和等位基因(A、G)在两组之间也存在统计学差异(P<0.05);而rs34741656的基因型(AA、AG、GG)和等位基因(A、G)在两组之间无统计学差异(P>0.05)。然而,单因素logistic回归分析显示:仅rs1981529的CC基因型可降低患超重及肥胖的风险(OR:0.410,95%CI:0.208-0.808,P=0.010);校正混杂因素后,上述关联性仍存在统计学意义(OR:0.367,95%CI:0.160-0.840,P=0.018)。结论STEAP4基因的rs1981529多态性与新疆维吾尔族人的超重及肥胖有关。rs1981529的CC基因型可能是新疆维吾尔族人超重及肥胖的保护因素。

STEAP4基因在人前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的观察人肥胖相关全长新基因STEAP4在人前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨STEAP4基因与脂肪细胞分化、脂质积聚的关系。方法体外培养人前体脂肪细胞,待细胞生长融合后以1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及罗格列酮联合诱导方案,在体外诱导其分化为成熟脂肪细胞。在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中观察细胞形态及脂质积聚变化;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(前体,第0、4、6、8、11、14、17天)脂肪细胞中STEAP4基因mRNA的表达水平。结果STEAP4基因高表达于人前体脂肪细胞;加入脂肪细胞分化诱导剂后(第4天)表达略有上调,其后随脂肪细胞分化成熟该基因表达量呈逐渐下降趋势;至脂肪细胞完全分化成熟(第14-17天)表达量最低。STEAP4基因表达水平除在诱导分化前至第4天、第14-17天差异无统计学意义外,余各时间点的表达水平差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论STEAP4基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调,可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖的发生有关。

STEAP4基因蛋白铁氧化还原酶活性分析

目的分析肥胖相关基因STEAP4的铁氧化还原酶活性。方法体外温箱培养昆虫细胞株(Sf9),分别将pAcSec1-STEAP4转移载体和pAcSec1-vector转移载体与SapphireTM杆状病毒基因组混合后共转染Sf9昆虫细胞,通过G418药物筛选稳定表达STEAP4蛋白的细胞株,并抽提细胞总蛋白进一步应用Western blot技术验证其转染情况。应用分光光度计法检测铁氧化还原酶活性。应用SPSS11.5软件进行统计学分析。结果 Western blot技术证实STEAP4过表达细胞株构建成功;分光光度计法检测STEAP4铁氧化还原酶活性,STEAP4过表达组A值为5.182 5±0.230 4,空载组A值为1.615 0±0.822 6,STEAP4过表达组铁氧化还原酶活性明显高于空载组,差异有统计学意义(Pa<0.001)。结论 STEAP4基因蛋白具有铁氧化还原酶活性。

TNFα对人脂肪细胞STEAP4基因表达的调控

目的人STEAP4基因是一个参与胰岛素敏感性调节的肥胖相关差异表达基因,本研究旨在探讨胰岛素抵抗相关脂源性细胞因子TNFα对人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的调节作用。方法体外培养人前体脂肪细胞,在诱导人前体脂肪细胞分化成熟的基础上,应用不同浓度(0、5、10、25、50ng/mL)人重组TNFα干预成熟脂肪细胞24h,采用实时荧光定量RT-PCR技术、Western blot技术检测干预后人成熟脂肪细胞STEAP4基因在核酸和蛋白表达水平的变化。结果不同浓度TNFα(5、10、25、50ng/mL)干预24h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因的mRNA表达,与未干预对照组差异有显著性(P<0.05);50ng/mLTNFα干预时STEAP4基因在人成熟脂肪细胞中的mRNA表达水平最高。与基因表达结果相一致,不同浓度TNFα(5、10、25、50ng/mL)干预24h能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4蛋白的表达,与未干预对照组差异有显著性(P<0.05);干预浓度提高到25ng/mL时干预效果最为明显。结论TNFα能显著上调人成熟脂肪细胞中STEAP4基因核酸和蛋白的表达。