产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术,构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测,证明外源基因已经整合到受体植物基因组中,同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得,为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。

大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表*达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf(+)-STI、K88ab(LT+,ST+)质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。

基于主题分类的作者影响力评价新指标STII研究

[目的/意义]为实现在主题分类基础上对作者影响力的评价,给出一种基于研究主题的作者影响力评价方法。[方法/过程]以中国引文数据库2010-2014年图书情报学16种核心期刊中的文献为样本,利用LDA模型对样本文献进行主题建模,将主题对文献的支持度与文献被引频次做乘法运算,计算特定主题文献的被引频次(Specific topic cited frequency,简称STCF);然后统计在特定主题下同一作者发表文献的STCF值之和,进而计算作者的特定主题影响力指数(Specific topic influence index,简称STII);根据每位作者在相应主题内的STII值对作者进行影响力排名。[结果/结论]基于主题分类的作者影响力分析,更好反映了作者发表文献的主题特征,体现出作者研究主题的多元性,研究视角更加全面合理,有效弥补了利用被引频次和h指数评价作者影响力的不足。

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。

生物素标记大肠杆菌STII基因探针的研制及应用

采用平板改良法提取了含 STⅡ基因的 pUC9-STⅡ重组质粒,以 Ps酶切,琼脂糖凝胶电泳后,垂直电泳洗脱,从凝胶中回收 STⅡ基因。用生物素-11-dUTP 通过缺口平移法制得生物素标记的STⅡ基因探针。点斑法杂交结果表明:该探针只与含 STⅡ基因的标准对照菌株质粒杂交阳性,与 STⅡ基因没有交叉,探针特异性好。通过对118株待检菌质粒杂交鉴定,发现其中45%的菌株带有 STⅡ基因。由于生物素标记探针易于制备,便于操作,可长期保存,因而适于一般实验室应用。

K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序

利用重叠延伸PCR技术将K88ac STⅡ融合基因克隆于T载体上,将重组基因质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过PCR、NcoI/XcoI酶切后测序,与genbank报道的K88ac结构基因序列进行比对,证明所克隆的目的片段为K88ac STII融合基因。