马铃薯蛋白激酶基因StPK1启动子的克隆及活性分析

【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基的不同。GUS组织化学染色表明,用晚疫病原菌或SA处理的转基因烟草被染成蓝色。【结论】StPK1启动子为有活性的启动子,且为病原和SA诱导型启动子。

甜菜M14品系BvM14-STPK基因的生物信息学分析及响应盐胁迫的表达分析

旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应,本研究以甜菜M14品系为材料,使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增,获得BvM14-STPK基因cDNA全长,并进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明,BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp,包含1527 bp的最大ORF,编码508个氨基酸;BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明,BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达,叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下,在叶片和根中呈现不同的表达状态,表明该基因可以应答盐胁迫,但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义,为进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。

甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白激酶在原核表达系统中的低温诱导表达及纯化

为获得纯化的BvM14-STPK蛋白激酶,采用低温16℃,0.5 mmol/L IPTG对转Bv M14-STPK的大肠杆菌进行诱导,利用Ni2+亲和层析技术对菌液上清进行纯化,并利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测。结果表明37℃,0.5 mmol/L IPTG诱导后,BvM14-STPK蛋白以包涵体形式存在,不能对目的蛋白进行纯化分析研究;通过优化诱导条件,在低温16℃,0.5 mmol/L IPTG过夜诱导,在上清中获得大量BvM14-STPK可溶性目的蛋白,对菌液上清纯化并经SDS-PAGE检测到BvM14-STPK目的蛋白。在目的蛋白纯化过程中,发现150 mmol/L咪唑洗脱液纯化BvM14-STPK目的蛋白效果最好。本研究成功纯化出目的蛋白BvM14-STPK。

亲自然,明责任--“STPK”课程的资源开发

在“STPK”课程实施过程中,幼儿园充分开发课程资源,探索生活中不同的区域和时机,培养幼儿对自然的亲近感、对社会的责任感。走进自然,将自然资源与幼儿园一日活动有机整合,顺应二十四节气的自然变化,在不同的节气开展幼儿食育实践,让美景、美味看得见;走进社区,把握节日时机,确定适宜的教育主题,协调相关社会群体力量,让人文、人情润无声。

小麦Stpk-V同源基因的克隆及全蚀菌诱导下的表达特征分析

由禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis vat．tritici）侵染引起的小麦全蚀病是小麦上一种重要的根部病害，广泛分布于世界各小麦种植区。近年来，小麦全蚀病在黄淮冬麦区发生呈上升趋势。选育和种植抗病品种是解决小麦全蚀病危害的根本途径，抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。

Tracing the location of powdery mildew resistance-related gene Stpk-V by FISH with a TAC clone in Triticum aestivum–Haynaldia villosa alien chromosome lines

Bacterial artificial chromosomes(BACs)or yeast artificial chromosomes(YACs)containing large inserts as probes for fluorescence in situ hybridization(FISH)have been used in the physical mapping of specific DNA sequences,especially for single-or low-copy sequences.Our earlier study identified Stpk-V,a powdery mildew resistance-related gene located on the 6VS chromosome arm of the wild grass Haynaldia villosa(tribe Triticeae),and obtained several Triticum aestivum–H.villosa alien chromosome lines carrying the Stpk-V gene.However,the precise physical location of the Stpk-V gene on chromosome 6VS is not known.In this study,we used TAC-FISH with TAC15 as the probe coupled with sequential genomic in situ hybridization(GISH)to determine the physical location of the Stpk-V gene in different T.aestivum–H.villosa 6V alien chromosome lines,including addition,substitution and translocation lines.The result indicated that the fraction length of the Stpk-V locus is 0.575±0.035 on the 6V chromosome short arm and this was confirmed by FISH using TAC15 as the probe for tracing the Stpk-V gene in other genetic stocks.The cytological mapping strategies used in this study will be of benefit for tracing the alien gene location in the course of introducing desirable traits from wild species.

棉花GhD6PKL2的克隆及功能验证

旨在探究丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,STPK)基因在棉纤维发育中的功能,解析棉纤维细胞的分化和发育机理。从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆基因GhD6PKL2,并对其序列及结构特征进行生物信息学分析、表达量分析及过表达拟南芥的表型观察。GhD6PKL2含有典型的STPK保守序列位点。预测编码的蛋白相对分子质量为49.74 kD,等电点为6.17,含有多个丝氨酸苏氨酸磷酸化位点。表达模式结果表明,GhD6PKL2在与棉花纤维伸长阶段相吻合的、开花后20 d显著高表达。软件预测及在烟草叶片中的荧光蛋白定位结果均显示,GhD6PKL2编码的蛋白质定位在细胞膜上。诱饵自激活试验验证GhD6PKL2没有自激活活性及毒性。过表达拟南芥,能使转基因拟南芥表现出表皮毛数量增多,同时主根变短、侧根数目增多的表型。表明该丝氨酸苏氨酸蛋白激酶基因在拟南芥表皮毛及主侧根发育方面发挥一定作用,可能为一个棉纤维伸长发育阶段的潜在调控基因。

分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究

【目的】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝杆菌类似真核样的蛋白激酶,预测在分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程中起着重要的作用,解析PknK的生物功能及作用机制,将为结核病的防治提供一定的理论基础。【方法】通过基因敲除等遗传方法获得结核分枝杆菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回补菌株pMV361-pknK/△pknK和过表达菌株pMV261-pknK/BCG;对获得的菌株进行生长曲线测定和抗药性分析;通过pulldown-MS方法及生物信息学方法鉴定了PknK相互作用蛋白。【结果】监测各种分枝杆菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生长,确定PknK负调控BCG生长;抗药性分析显示PknK降低BCG的耐药性;pulldown-MS方法显示PknK与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和双组分系统中的反应调节因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【结论】研究发现PknK调控分枝杆菌的生长和耐药性,我们的研究为深入研究PknK在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础。

Streptomyces coelicolor A3(2) M145中丝/苏氨酸蛋白激酶基因prkC的功能初探

目的对Streptomyces coelicolor A3(2)M145中编码丝/苏氨酸蛋白激酶PrkC的基因SCO3848进行功能初探。方法对PrkC蛋白序列进行生物信息学分析,在S.coelicolor A3(2)M145中敲除prkC基因,并进行互补、和过表达实验,对比突变菌株生长、次生代谢物产量、孢子萌发效率等。结果 prkC基因在S.coelicolor A3(2)M145孢子萌发、生长、次生代谢等方面均起重要作用。结论 prkC是一个多效调节基因,其具体生理功能和作用机制有待深入研究。