STX1B 基因突变相关癫痫3例报告

本文回顾分析3例STX1B基因变异相关癫痫患儿的临床资料,进行临床表型分析和基因型分析,并复习相关文献。3例均为男性患儿,起病年龄分别为8月龄、18月龄及28月龄。癫痫发作分别表现为全面性强直阵挛发作、局灶性发作及部分继发强直阵挛发作。3例患儿经基因检测证实为STX 1B基因变异,分别为c.280+2_280+3delTG(Splice-5)、c.820C>G(p.L274V)及c.845T>C(p.I282T),其中2个位点目前鲜有报道。STX 1B基因变异相关癫痫存在临床异质性,本文报告的3例丰富了目前已知的STX 1B基因突变谱。

干扰STX18-AS1通过靶向miR-204保护心肌细胞

目的探讨干扰长链非编码RNA STX18-AS1(long non-coding RNA,LncRNA STX18-AS1)是否通过上调微小RNA-204(miR-204)的表达从而影响心肌细胞缺氧损伤。方法体外培养心肌细胞H9C2,采用二氯化钴(CoCl_(2))处理心肌细胞建立细胞缺氧损伤模型,采用qRT-PCR检测CoCl_(2)处理不同时间点STX18-AS1、miR-204的表达量;实验设置对照组、模型组、si-NC组、si-STX18-AS1组、miR-NC组、miR-204组。采用甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖活性;流式细胞术与TUNEL检测细胞凋亡率;采用生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性;双荧光素酶报告实验验证STX18-AS1、miR-204的靶向关系。结果与对照组比较,在CoCl_(2)处理6 h、12 h、18 h、24 h时模型组和si-NC组STX18-AS1表达水平升高(P<0.01),miR-204表达水平降低(P<0.01);与模型组、si-NC组比较,在CoCl_(2)处理6 h、12 h、18 h、24 h时si-STX18-AS1组STX18-AS1的表达水平降低(P<0.01),miR-204的表达水平升高(P<0.01);与对照组比,模型组、si-NC组细胞增殖活性降低(P<0.01),细胞凋亡率及LDH活力、MDA的水平升高(P<0.01),SOD、CAT的活力降低(P<0.01);与模型组、si-NC组比较,si-STX18-AS1组细胞增殖活性升高(P<0.01),细胞凋亡率及LDH活力、MDA的水平降低(P<0.01),SOD、CAT的活力升高(P<0.01);转染miR-204mimics对心肌细胞增殖活性、凋亡及氧化应激的作用与转染si-STX18-AS1的作用相同;双荧光素酶报告实验证实STX18-AS1可靶向结合miR-204。结论干扰STX18-AS1表达可能通过上调miR-204,抑制细胞凋亡、促进增殖,减轻CoCl_(2)诱导的心肌细胞氧化损伤。

丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157 Stx毒素表达的影响

【目的】确定丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157中Stx前噬菌体和Stx毒素的诱导作用。【方法】利用丝裂霉素C作诱导剂对8株溶原性大肠杆菌O157进行噬菌体诱导,以MC1061作指示菌采用双层琼脂平板法观察诱导前后的噬菌斑,并采用PCR方法对噬菌体进行鉴定。同时测定8株溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导前以及诱导8、12、16h这4个阶段滤液中Stx毒素的表达量,毒素表达量采用WST-1细胞毒性检测试剂盒检测Vero细胞存活率。【结果】溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导后释放大量的Stx噬菌体颗粒。同时诱导后Stx毒素的表达量也显著增加,且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续增加,但增加的幅度逐渐减缓。【结论】本研究确定了丝裂霉素C可以诱导溶原性大肠杆菌O157释放Stx噬菌体,同时也增加了Stx毒素的表达,从而增强细菌的毒力。

志贺毒素2型噬菌体ΦMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

【目的】通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性。【方法】利用λ噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因(cat)插入到大肠杆菌O157:H7Min27株的stx2基因中,获得O157:H7Min27的突变菌株Min27(△stx∷cat)。用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体,命名为ΦMin27(△stx∷cat)。采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察ΦMin27(△stx∷cat)感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况。【结果】2株血清型分别为O60和O138的大肠杆菌可以被ΦMin27(△stx∷cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解。溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的ΦMin27(△stx∷cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑。【结论】ΦMin27(△stx∷cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出ΦMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础。

动物源E.coli O157:H7 stx基因的检测与系统进化分析

为了解2009-2010年间在河南、甘肃地区分离鉴定的5株大肠埃希菌O157(E.coli O157)携带stx的情况及不同分离株间stx分子进化与变迁的情况,本研究利用PCR方法对分离株进行了stx基因检测,并完成了序列测定与系统演化分析。结果表明,5株不同动物源的分离株均含有stx1及stx2基因。序列分析结果显示5株分离株间stx1、stx2的核苷酸及氨基酸同源性均较高;stx1基因均与参考株中的山羊源和食品源E.coli O157菌株的同源性较高,进化树中遗传距离最近;分离株的stx2基因与多株牛源及少数人源参考株也具有较高的同源性,进化树中虽然5株分离菌均在一个大主干分支中,但分离株27与其他各分离株及参照株遗传距离最远,独自处于一次级分支中;分离株L37与W、12与50分别分布于牛源、人源E.coli O157小次级分支中;由此可推测,分离株所携带的stx1很有可能是经食品源或羊源E.coli O157传递而来;分离株L37与W、分离株12与50的stx2可能是由牛源、人源E.coli O157菌株传递而来,分离株27的stx2来源不清楚。研究结果表明,5株E.coli O157分离株均含有stx1、stx2基因,但两个基因的起源存在差异。

EHEC O157 △ler/stx (pBR322::stx1/2B::eae)对小鼠免疫保护作用的实验研究

通过粘膜免疫途径对基因工程菌EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)进行小鼠免疫保护作用实验研究。结果表明,用EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)灌胃免疫小鼠能够诱导小鼠产生抗EHEC O157特异性免疫应答,两次免疫后7d,免疫组血清IgG抗体显著高于对照组,14 d检测IgG抗体达到最高峰,粪便中检测到高水平的抗EHEC O157特异性IgA抗体,表明该工程菌可以诱导肠道粘膜免疫应答和系统免疫应答。EHEC O157强毒株经胃肠道途径攻毒后,一次免疫组和两次免疫组小鼠存活率(67%和78%)均高于未免疫组(50%);免疫小鼠强毒菌排菌时间大大缩短,两次免疫组攻毒后第5 d检测不到强毒菌,未免疫组排菌达10 d以上;攻毒后免疫组小鼠体重较快恢复正常水平。

EHEC O157Δler/stx(pBR322∷stx 1/2B∷eae)的构建与生物学特性分析

为了获得安全性好，对出血性大肠杆菌具有良好免疫保护作用的疫苗株，本实验以构建的O157△ler／stx基因缺失突变株为载体，将决定特异性粘附的eae全基因插入到质粒pBR322∷stx 1／2B中，构建了基因工程菌O157△ler／six（pBR322∷stx 1／2B∷eae），对该基因工程菌进行生物学特性分析，实验结果表明，该菌正常培养可表达eae；具有粘附HEp-2细胞的特性；该菌培养上清对Vero细胞没有毒性作用；给小鼠口服接种该工程菌后可在肠道中定居至少10d；14日龄小鼠口服活菌量为5×10^9CFU／只，小鼠生长正常，没有出现任何临床症状；该菌通过口服免疫小鼠可以诱导肠道粘膜免疫应答和体液免疫应答。这些结果表明，该工程菌安全性好，免疫原性强，是有价值的预防EHEC O157感染的基因工程疫苗候选株。

蒙古马突触融合蛋白17(STX17)基因多态性及在不同毛色皮肤组织中的表达分析

为研究突触融合蛋白17(STX17)基因与蒙古马毛色之间的相关性及其作用机制。本研究利用半巢式PCR技术及实时荧光定量PCR技术对蒙古马STX17基因第6内含子的多态性以及不同毛色蒙古马皮肤组织中STX17基因的相对表达量进行了检测。巢式PCR结果显示:STX17基因在青毛蒙古马第6内含子处存在4.6kb的重复片段,在其它毛色中不存在该重复片段;荧光定量PCR结果显示:STX17基因在蒙古马青毛皮肤组织中表达量最高,在骝毛皮肤组织中的表达量最低。结果证明蒙古马STX17基因与其青毛表型具有典型的相关性。

产志贺毒素大肠杆菌stx2a和stx2b的血清和牛奶抗体检测

于新桥医院采集健康人群血清535份,两个屠宰场采集商品猪血清415份,5家奶牛场和1家奶站采集新鲜牛奶326份,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清(牛奶)中的stx2a和stx2b抗体.用P/N>2.1作为阳性判定标准,535份健康人群血清检测到stx2a抗体阳性和stx2b抗体阳性血清各21份(3.93%);415份商品猪血清检测到stx2a抗体阳性血清4份(0.96%),stx2b抗体阳性血清2份(0.48%);326份新鲜牛奶检测到stx2a抗体阳性血清25份(7.46%),stx2b抗体阳性血清21份(6.44%).牛奶中stx2抗体阳性率最高,健康人群血清次之,商品猪血清的阳性率最低.由此表明重庆市STEC菌株中携带stx2基因.

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

EHECO157∶H7stx基因缺失突变株的构建及其特性

针对肠出血性大肠杆菌 (EHEC) O1 5 7∶H7的 stx基因 ,通过 PCR扩增出缺失了 1 83bp的 stx基因片段 ,将其克隆到自杀性载体 p CVD4 4 2中 ,然后通过接合性转导将重组自杀性质粒 p CVD4 4 2∷Δstx从大肠杆菌 SM1 0转到 O1 5 7∶ H7中 ,利用抗性标记和 PCR方法筛选出 O1 5 7∶ H7stx基因缺失突变菌株。Vero细胞毒性试验证实 ,该突变株不能产生完整的 Stx。动物试验表明 ,与强毒株相比该突变株的致病性明显降低。该突变株的构建为研究志贺毒素在 EHEC O1 5 7感染中所起的作用和研制 O1 5

大肠杆菌毒力基因Colv、Stxs和HlyE的PCR检测(英文)

[目的]了解鸡源、猪源、食品源大肠杆菌Colv、Stxs(stx2、stx2e)、HlyE三种致病基因的存在情况。[方法]以44份鸡源、24份猪源、26份食品源的大肠杆菌菌株为试验材料,用PCR扩增方法分别对其Colv、Stxs(stx2、stx2e)和HlyE三种致病基因进行检测。[结果]检测的大肠杆菌菌株中,鸡源大肠杆菌菌株大肠杆菌素基因Colv检出率为25%,猪源大肠杆菌菌株大肠杆菌素基因Colv检出率为4.2%,食品源中没有检出;所有鸡源、猪源、食品源大肠杆菌菌株均没有检出类志贺毒素基因Stx2(Stx2e);鸡源大肠杆菌菌株溶血素E基因HlyE检出率为2.27%,猪源大肠杆菌菌株中没有检出,食品源大肠杆菌菌株溶血素E基因HlyE检出率为7.7%。[结论]大肠杆菌素基因Colv在鸡源和猪源大肠杆菌中有较高的携带率,溶血素E基因HlyE在鸡源和食品源大肠杆菌中也有一定程度的存在。

肠出血性大肠杆菌O157:H7△hly△stx△toxB基因缺失株的构建

肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157:H7是食源感染的人兽共患病原菌。志贺毒素(Shiga toxin,Stx)、溶血素(haemolysin,Hly)和ToxB是O157:H7重要的毒力因子。选用自杀性质粒pMEG375,体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,借助于sm10宿主菌获得O157:H7杂交菌株,通过同源重组,依次获得O157:H7(△hly△stx△toxB)基因缺失株,△hly△stx△toxB接种HEp-2细胞和感染链霉素处理的Balb/c小鼠,明确缺失株粘附定植的能力。经PCR鉴定,hly、stx和toxB基因分别被壮观霉素(Spc+)、庆大霉素(Gm+)和卡那霉素(Kan+)基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,O157:H7(△hly△stx△toxB)检测不到相应的Stx、Hly和ToxB蛋白。O157:H7(△hly△stx△toxB)生长特性与亲本株无明显差异。对于HEp-2细胞的粘附能力明显降低。Balb/c小鼠排菌时间和排菌量明显减少和降低。本研究成功获得O157:H7(△hly△stx△toxB),并且明确Stx、Hly和ToxB的缺失导致了O157:H7对HEp-2细胞和Balb/c小鼠的粘附和定植能力降低。本研究旨在为研制EHEC O157:H7基因缺失疫苗奠定物质基础。

大肠杆菌毒素stx2eB-LTB-ST融合基因的构建与表达

利用PCR技术,从病原性大肠杆菌中扩增Stx2e及LT毒素B亚基的基因并扩增ST基因,用复式PCR技术获得了这三段基因的两种融合结构,一种是三段基因直接相连,另一种是在这三段基因之间加入适当的Linker序列。在这两种融合基因两端加入适当的酶切位点并分别与pMD18-T载体相连,酶切后以正确的阅读框插入pET28a载体的多克隆位点中,转入受体菌BL21(DE3)进行表达,得到两种约28 Ku的蛋白,表达的融合蛋白均以包涵体的方式存在,约占全菌蛋白表达量的30%,将包涵体初步提纯,为下游工作奠定了基础。

重组大肠杆菌LTB-Stx2B蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究

为了筛选大肠杆菌疫苗的有效抗原,本研究表达了重组蛋白Stx2B和重组蛋白LTB-Stx2B,并分别用重组蛋白Stx2B、表达了重组蛋白LTB-Stx2B的灭活菌液和灭活菌裂解液免疫昆明鼠,比较了不同抗原诱导小鼠的体液免疫应答能力;体内体外实验对免疫血清的毒素中和作用进行了检测。结果显示,重组蛋白LTB-Stx2B能诱导小鼠更高水平的体液免疫应答,其血清抗体可以通过乳汁传递给新生仔鼠;小鼠二免后的血清不仅能中和LT和Stx2对小鼠的毒性作用,而且能中和Stx2对Vero细胞的毒性,其中和效价为1:52,高于其他免疫原组血清。该研究为大肠杆菌疫苗的研究奠定了基础。

产志贺毒素大肠杆菌流行病学和stx基因研究进展

感染产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-pro-ducing Escherichia coli,STEC）能引起人严重的疾病,包括：出血性肠炎（Hemorrhagic coltis,HC）、血栓性血小板紫癜（TTP）和溶血性尿毒综合症（He-molyticuremicsyndrome，HUS）甚至死亡。

产志贺毒素大肠杆菌O138 stx2e基因的克隆与序列分析

目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。

ShRNA靶向沉默STX8基因对U251细胞增殖和迁移侵袭的影响

目的探讨敲低STX8基因对脑胶质瘤细胞瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法构建STX8-sh RNA-p Super表达载体转染U251细胞,分别用CCK8法、划痕实验、Transwell实验检测细胞增殖、迁移侵袭能力。结果 CCK8法、划痕实验、Transwell实验结果显示,STX8干扰后细胞增殖、迁移侵袭能力显著下降。结论 STX8基因的敲低能有效抑制U251细胞增殖、迁移侵袭能力,STX8基因有可能成为胶质母细胞瘤基因治疗的新靶点。

产志贺毒素EHEC国内分离株Stx2基因的克隆及生物信息学分析

通过对来源于人和牛粪的EHEC的Stx2基因的克隆,并利用生物信息学方法对3株菌Stx2基因的序列进行分析,结果表明:EHEC94H的Stx2序列与标准株Stx2,Stx2c,Stx2d核苷酸序列同源分别为99.8%,99.5%,90.9%,EHEC 042的Stx2序列与标准株Stx2,Stx2c,Stx2d核苷酸序列同源性分别为98.9%,98.9%,90.5%,EHEC 094的Stx2序列与标准株Stx2,Stx2c,Stx2d核苷酸序列同源性分别为97.9%,98.0%,87.1%。

STX3基因突变致微绒毛包涵体病的基因诊断

目的探讨微绒毛包涵体病(microvillus inclusion disease,MVID)患儿临床表型与基因型的关系,以提高对MVID的认识。方法 2017年4月,1例MVID患儿在南方医科大学珠江医院新生儿科住院治疗,2017年6月采用二代测序法对患儿及其父母进行基因测序,采用一代测序方法对患儿胞兄进行定点突变检测。回顾性分析患儿临床表现、治疗、预后及家系基因测序结果。结果患儿女,胎儿期提示肠管扩张,生后第2天开始出现腹泻,为黄绿色黏液样便,合并多种电解质紊乱及代谢性酸中毒。基因测序结果显示,患儿STX3基因无义突变,突变位点为c.424C>T和c.739C>T,分别遗传自表型正常的父母。患儿胞兄8岁,表型正常,测序结果显示有STX3基因的1个杂合突变,位点为c.424C>T(p.R142),突变来源于表型正常的母亲。该突变为国内首次报道。结论 STX3基因分析有助于微绒毛包涵体病的诊断。