EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

EHEC O157∶H7志贺毒素ⅡA1亚单位蛋白的构建表达与免疫原性鉴定

目的构建表达GST-STX2A1融合蛋白并鉴定其免疫原性。方法通过PCR反应从EHEC O157∶H7EDL933标准株菌中扩增STX2A1基因,将此基因克隆到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6p-1,得到阳性克隆PGEX-6p-1/STX2A1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导GST-STX2A1融合蛋白的表达,采用亲和层析纯化该蛋白,SDS-PAGE分析其表达量、表达形式和纯度;用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,免疫双向扩散鉴定抗血清效价,Western blotting鉴定抗血清的特异性。结果成功构建重组质粒PGEX-6p-1/STX2A1,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,并在大肠杆菌中表达出Mr约为5.3×104大小的可溶性目的蛋白,经亲和层析纯化后纯度可达90%,免疫Balb/c小鼠产生的抗血清效价为1∶16,Western blotting表明可与天然STX2A蛋白反应。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的GST-STX2A1融合蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,为O157∶H7亚单位疫苗及制备抗STX2A1的单克隆抗体提供了必要的物质基础。

肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素ⅡA1亚单位单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定

目的制备出高效价的抗志贺毒素ⅡA1亚单位(STX2A1)的单克隆抗体。方法以重组GST-STX2A1融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用细胞杂交瘤技术制备,以天然STX2毒素为筛选抗原,采用间接ELISA法筛选产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用Protein A-Sepharose柱对其纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类,采用间接ELISA相加实验鉴定抗原识别表位。结果获得3株产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株STX2-1A3、STX2-1E10、STX2-3A7,Ig亚类分别为IgG1λ型、IgG1κ型和IgG3κ,亲和力常数分别为5.76×109、1.21×109和3.97×108。结论成功制备3株稳定分泌抗STX2A1的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体特异性好,亲和力高,能与天然STX2A亚单位反应。