suc2基因的克隆及在酵母基因组中的定位突变

目的 克隆酿酒酵母的蔗糖转换酶基因 (suc2 ) ,并定位突变酵母基因组中的 suc2基因以获得无蔗糖转换酶表达的酵母品系 .方法 用 PCR法从酵母 Y190基因组中扩增出suc2的成熟肽基因片段 ,克隆后测序 .将色氨酸合成酶 (TRP)基因片段插入 suc2基因中 ,构建成用于同源重组的 suc2基因定位突变载体 .导入酵母 Y190 ,用营养缺陷筛选出 suc2基因突变的克隆 .用 PCR扩增并克隆突变后的 suc2基因 ,用序列分析确定同源重组的发生 .结果 用 PCR从酵母基因组DNA中扩增出大小约 1.5 kb的 suc2基因片段 ,序列测定表明除 5 85位有一点突变 (AAC变为 AAT)外 ,所得 suc2基因与文献报道相同 ;构建的定位突变载体导入酵母细胞后 ,得到4株营养型符合的突变体 ;PCR表明这些突变体中均有 suc2基因的同源重组 ;取其中 1株的 PCR产物进行序列测定证实了同源重组的发生 .结论 克隆了正确的编码蔗糖转换酶成熟肽的 suc2基因片段 ;用同源重组方法在酵母 Y190的基因组中定位突变了

酿酒酵母中的蔗糖转换酶基因(SUC2)研究进展

蔗糖转换酶基因(SUC2)编码蔗糖转换酶(Invertase),通过降解酵母细胞外的蔗糖成果糖和葡萄糖来提供酵母生长所需的碳源,在以蔗糖为主要碳源的培养条件下,蔗糖转换酶对于酵母生长必不可少,因此研究蔗糖转换酶基因序列、转录、调控等对酵母蔗糖代谢具有重要意义。蔗糖转换酶基因的表达受葡萄糖浓度、氧气和其在染色体上的位置等因素的影响。本文就葡萄糖浓度对SUC2表达的影响以及葡萄糖浓度对其表达调控的机制进行了综述,并展望了该基因及蔗糖转换酶在今后的应用和研究趋势。

酵母ADH2-SUC2融合启动子的构建及其对基因表达的调控

将ＡＤＨ２基因的ＵＡＳ与带有不同长度缺失上游区的ＳＵＣ３基因融合，构建成４种具有不同融合启动子的ＳＵＣ２基因的表达质粒ＹＲＤ１１０１．ＹＦＤ１１０△９．ＹＦＤ１１０△１７、ＹＦＤ１１０△１１。将这些质粒及对照表达质粒ＹＦＤ２６△１．ＹＦＤ２５转化酵母菌Ｙ３３，在阻遏与去阻遏培养条件下，对各种转化子所产生的蔗糖酶进行了活性测定和组分分析。结果表明：在葡萄糖去阻遏生长条件下，ＹＦＤ１１０△１的启动子组合中ＵＡＳｓｕｃ２和ＵＡＳＡＤＨ２对ＳＵＣ２基因的表达有协同激活作用。在阻遏条件下Ｙ３３／ＹＦＤ１１０△１与Ｙ３３／ＹＦＤ１１０△９、Ｙ３３／ＹＦＤ２６△１、Ｙ３３／ＹＦＤ２５一样，均表达很低的糖基化蔗糖酶，３种去阻遏培养条件比较说明。

酵母SUC2基因上游顺序对其表达的影响

从SUC2基因上游约—900bp向起始密码进行系列缺失。将带有这种缺失上游区的SUC2基因插入多拷贝质粒,并转化进不产蔗糖酶的酵母细胞。测定了这些缺失株表达蔗糖酶的数量。结果表明:在葡萄糖阻遏条件下,SUC2上游区缺失从-636bp到-179bp的不同细胞,糖基化蔗糖酶的表达量逐渐升高。和野生型相比,SUC2上游区缺失到-223bp和-179bp的细胞糖基化蔗糖酶量增加100倍以上。在葡萄糖去阻遏条件下,SUC2上游缺失从-395bp到-179bp的不同细胞,糖基化蔗糖酶的表达量只显示微弱的去阻遏效应。缺失末端达-89bp和-41bp的细胞只表达很少的糖基化蔗糖酶,但是非糖基化蔗糖酶的表达量明显增加。

化学合成的人α-心房肽基因在SUC2启动子-信号顺序控制下的表达

本文报道将化学合成的人α-心房肽(α-hANP)基因与酵母分泌型表达载体YFD6A21重组,使α-hANP基因在蔗糖酶基因(SUC2)启动子-信号顺序指导下,在酵母菌中合成和分泌有活性的α-hANP。放射免疫分析表明:α-hANP基因只有在葡萄糖去阻遏条件下才能得到表达,而且其表达量与细胞浓度成正比。此外,95%以上表达产物被分泌到培养液中。

不同信号肽对酿酒酵母蔗糖转化酶Suc2分泌表达水平的影响

目前,绝大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限,而蔗糖转化酶Suc2是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能。为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶Suc2的分泌表达水平,利用生物信息学的分析方法选择出11种不同的分泌信号肽,包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽,将它们融合至Suc2并构建了相应的酿酒酵母BY4741重组菌。其中,酿酒酵母内源分泌信号肽AGA2能使蔗糖转化酶Suc2更有效的分泌,含有信号肽AGA2的重组菌BY-AG的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌BY-S分别提高42%和26%,其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了32%,乙醇产量达到78.11 g/L。在使用毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌信号肽MSB2时,蔗糖转化酶Suc2的分泌水平也有提高,含有信号肽MSB2的重组菌BY-MS较原始菌BY-S的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了80%和74%,同时,利用菊糖产乙醇能力也提高了56%,产量达到86.31 g/L。最后,对重组菌BY-MS摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测,结果表明,重组菌BY-MS的发酵性能较原始菌BY-S有显著提高。本研究为提高蔗糖转化酶Suc2的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考。

拟南芥SUC2-1突变体的快速繁殖

以拟南芥SUC2-1突变体为材料研究了快速繁殖的方法。

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径suc2基因的敲除及其蔗糖代谢特性的变化分析

蔗糖基生物质是热带和亚热带地区重要的生物质材料,因而在微生物发酵和微生物代谢原料中具有重要的地位。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有以蔗糖为原料进行代谢的能力,在酿酒酵母的基因组中蔗糖水解酶基因共有6个结构基因。本研究以酿酒酵母INVSC1为出发菌株,首先利用基因敲除技术构建suc2基因缺失菌株,然后将suc2基因回补,从而研究suc2基因对酿酒酵母蔗糖关键代谢途径及蔗糖代谢特性的影响。以蔗糖为碳源的发酵培养基中,在静置条件下发酵,suc2基因缺失菌株失去了利用蔗糖代谢的能力,回补菌株则恢复了对蔗糖的代谢;而且回补菌株对蔗糖的利用率及乙醇产量均比出发菌株有所提高。suc2基因是酿酒酵母蔗糖代谢的关键基因,对蔗糖的代谢具有决定性作用,可以作为蔗糖代谢途径改造的一个关键点。

ncRNA候选基因spt1的克隆与初步分析

在用suc2信号肽捕获系统对小鼠胚胎cDNA文库筛选的过程中 ,反复获得一个相同的强阳性克隆 ,命名为spt1。对该克隆的序列分析表明 :插入序列由 6 97bp组成 ,6个开放阅读框中共有 37个启始密码子 (ATG)和 80个终止密码子 (TGA、TAG、TAA) ;没有较大的有意义开放读框存在。经BLAST分析 ,结果显示该序列定位于小鼠第17号染色体长臂 ,没有发现同源基因。Northernblot和RT PCR分析表明 ,该序列仅表达于小鼠卵巢组织 ,全长约4 5～ 5 0kb。酵母转化和序列截短实验提示 ,该序列能够介导蔗糖转换酶向细胞外的分泌。因此 ,推测spt1很有可能是一个新的非编码RNA的一部分 ,参与蛋白质的分泌过程。

蔗糖利用型毕赤酵母工程菌的构建

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近20年来应用最广泛的真核表达系统之一,已有500多种蛋白在该系统得到了成功表达,然而在毕赤酵母基因组中却缺少蔗糖酶基因,因此无法利用蔗糖。本研究从酿酒酵母基因组中克隆得到蔗糖酶基因SUC2。将SUC2亚克隆后得到表达载体pPICZαA-SUC2。经电转化后,表达载体整合进入毕赤酵母KM71H基因组,得到能够利用蔗糖的毕赤酵母工程菌。

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度为20~24核苷酸(nucleotide,nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),在植物生长发育过程中具有重要作用.为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子,利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系,通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体.对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和全基因组测序实验.结果显示,突变的基因为Ago1(Argonaute 1),该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白,成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控.验证了该筛选体系的可行性.通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA活性或miRNA运输等通路的因子,为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础.

一种新型巴斯德毕赤酵母表达载体的构建及甘露聚糖酶的表达

目的:构建以带自身启动子的蔗糖转化酶基因(suc2)为选择标记的载体,用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法:根据已发表的蔗糖转化酶基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以啤酒酵母INVSC1总DNA为模板,扩增出包含自身启动子和终止区序列的suc2基因。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了以suc2为选择标记的表达载体pPIC12K。将甘露聚糖酶基因man克隆入载体pPIC12K,用PEG/LiCl法转化毕赤酵母GS115菌株。以蔗糖为惟一碳源筛选转化子,利用底物平板检测筛选到的转化子中man基因的表达,并对重组表达菌株进行连续传代实验。结果:部分转化子周围产生明显的水解圈,证明甘露聚糖酶已经得到分泌表达;对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性。结论:以带自身启动子的suc2基因为选择标记的表达载体构建成功,并且这个新型表达载体能够对外源基因进行稳定有效的分泌表达。