人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21(DE3)pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1∶20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果:重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论:成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。

SUMO-2/3与孕激素受体的共价结合及其对该受体转录活性的调节

目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;将质粒pXJ40-myc-PRB分别与pcDNA3-FLAG、pcDNA3FLAG-SUMO2、pcDNA3FLAG-SUMO3共转染人胚肾细胞293T,运用免疫共沉淀及western印迹的方法检测其是否发生类泛素化修饰;运用测定荧光素酶报告基因的方法检测类泛素化修饰对孕激素受体转录活性的影响。结果构建成功表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;免疫共沉淀实验证实sumo2/3均可以与PRB共价结合;SUMO-2、SUMO-3能以孕激素依赖的方式增强PRB的转录活性。结论 SUMO-2、SUMO-3分子能够对孕激素受体PRB进行类泛素化修饰,并调节其分子功能。

SUMO-1共价修饰ataxin-3

为了探讨ataxin-3的正常生理功能以及脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病机理,采用酵母双杂交技术,选择polyQ扩展突变型ataxin-3全长构建诱饵质粒,筛选成人脑cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质,筛选到互作蛋白smallubiquitin-likemodifier1(SUMO-1).进一步运用免疫共沉淀技术证实,SUMO-1在哺乳动物细胞中共价修饰野生型和polyQ扩展突变型ataxin-3.免疫荧光共定位实验发现,polyQ扩展突变型ataxin-3形成的核内蛋白聚合体与SUMO-1共定位.研究提示,ataxin-3的正常生理功能可能受SUMO-1的调节,SUMO-1可能参与了脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病机制.

SARS冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性

SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性.实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15(DeISGylation)活性.研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro.但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性.SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础.

SUMO特异性蛋白酶3通过调控巨噬细胞极化促进磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤形成

目的:探讨SUMO特异性蛋白酶3(SENP3)调控巨噬细胞极化在磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤(AAA)形成中的作用。方法:(1)分离C57BL/6背景的Senp3flox/flox(野生型,WT)小鼠和Senp3flox/flox;Lyz2-Cre(SENP3单核细胞特异性敲除,即条件性敲除,c KO)小鼠骨髓来源的单核细胞(BMDMs),分别诱导其M1/M2型分化,采用RT-q PCR、Western blot和细胞免疫荧光比较SENP3表达以及M1/M2型巨噬细胞分布差异。(2)8~12周龄雄性WT小鼠和c KO小鼠用改良型磷酸钙诱导14 d构建小鼠AAA模型,比较两组小鼠的成瘤率和生存率;RT-q PCR和Western blot检测SENP3、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6及基质金属蛋白酶9(MMP-9)在两组小鼠AAA组织中的表达差异;二氢乙啶染色检测组织中活性氧簇(ROS)生成差异。(3)为探讨其中机制,通过Western blot和免疫共沉淀验证SENP3与丝裂原活化蛋白激酶激酶7(MKK7)的相互作用;在BMDMs中转染FlagMKK7野生型(Flag-MKK7 WT)和SUMO修饰位点K18突变体(Flag-MKK7 K18R mutant)后诱导BMDMs进行M1极化,用Western blot检测p-JNK和MMP-9表达的差异。结果:(1)SENP3在M1型巨噬细胞中表达显著升高(P<0.01),在M2型巨噬细胞中显著下调(P<0.01);SENP3在M1向M2型巨噬细胞转化过程中表达显著下降(P<0.01),而在M2向M1型巨噬细胞转化时表达显著上调(P<0.01);c KO组BMDMs经M1/M2型诱导后,巨噬细胞M1型少于WT组,而M2型多于WT组;(2)SENP3在AAA组织中表达上调(P<0.05);c KO小鼠磷酸钙诱导后成瘤率显著降低(P<0.01),生存率显著提高(P<0.05),最大腹主动脉外直径显著减小(P<0.01);c KO小鼠AAA组织中IL-1β、IL-6和TNFα表达显著下调(P<0.01),ROS生成减少,MMP-9表达也显著下调(P<0.05)。(3)M1巨噬细胞中,MKK7的SUMO2/3修饰减少,与SENP3的相互作用增强;突变回补实验说明,转染Flag-MKK7 K18R mutant的M1型巨噬细胞中p-JNK和MMP-9表达显著上调(P<0.05)。结论:SENP3通过去SUMO化修饰MKK7,激活MAPK/JNK通路,调控巨噬细胞的极化,上调MMP-9的表达,从而促进AAA形成。

SUMO特异肽酶3调控小鼠睾丸Sertoli细胞自噬

目的·探讨小鼠睾丸中SUMO特异肽酶3(SUMO specific peptidase3,SENP3,又称SUMO特异蛋白酶3)对自噬的调控作用。方法·采用免疫荧光法对SENP3在睾丸生精细胞和支持细胞(Sertoli cells,简称Sertoli细胞)中的定位进行检测。对Senp3野生型(Senp3+/+)小鼠和Senp3基因敲除杂合子(Senp3+/-)小鼠进行饥饿处理,诱导自噬的发生。提取小鼠的睾丸组织蛋白质,采用Western blotting检测自噬的程度。利用透射电子显微镜技术、免疫荧光法检测睾丸组织切片中的细胞自噬,并区分睾丸生精细胞和Sertoli细胞自噬的程度。结果·SENP3主要定位于Sertoli细胞核。与Senp3+/+小鼠相比,Senp3+/-小鼠饥饿后,Sertoli细胞自噬增加。结论·SENP3能够抑制营养缺乏时Sertoli细胞自噬,可能对细胞自噬的程度发挥控制作用。

SENP3对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响

目的:探讨小泛素样修饰物(SUMO)/sentrin特异性蛋白酶3(SENP3)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞泡沫化的影响及其机制。方法:利用慢病毒感染并筛选构建4组稳转细胞,分为SENP3过表达组和对照组人源THP-1单核-巨噬细胞,以及SENP3敲减表达组和对照组小鼠RAW264.7巨噬细胞,利用ox-LDL诱导巨噬细胞构建泡沫细胞模型。采用油红O染色检测细胞内脂滴沉积;用试剂盒酶法测定细胞内胆固醇含量;Westernblot检测SENP3的表达量,以及pro-caspase-1的表达量和剪切情况;ELISA法检测细胞中促炎因子白细胞介素1β(IL-1β)的分泌。结果:与对照组相比,SENP3过表达显著降低THP-1细胞内脂滴含量,SENP3敲减表达显著提升RAW264.7细胞内脂滴含量;与对照组相比,SENP3过表达细胞内总胆固醇、胆固醇酯和胆固醇酯化率均显著降低(P<0.05或P<0.01);SENP3的表达量随ox-LDL刺激时间增加而显著下降(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,SENP3过表达组pro-caspase-1的表达量没有显著差异,而剪切体caspase-1(p20)的含量显著下降(P<0.01);与对照组相比,SENP3过表达组细胞分泌的IL-1β蛋白量显著下降(P<0.05)。结论:SENP3蛋白可显著抑制巨噬细胞泡沫化,该作用可能是通过抑制炎症小体的激活实现的。

嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症SUMO特异性蛋白酶3表达降低促进替代激活巨噬细胞极化

目的探讨SUMO特异性蛋白酶3(SENP 3)在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中对巨噬细胞极化产生的影响。方法嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症患者鼻黏膜组织中CD68、CD206、SENP3免疫荧光染色共定位。用白细胞介素-4(IL-4)和IL-13刺激SENP3基因敲除小鼠和对照小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM),体外诱导巨噬细胞极化。利用SENP3基因敲除小鼠建立嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症动物模型,用免疫荧光共定位检测F4/80、CD206。结果在SENP3基因敲除小鼠建立的嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症模型中,鼻黏膜中CD206^(+)细胞数量显著增加。在体外诱导BMDM极化过程中,敲除SENP3使F4/80^(+)CD206^(+)细胞数量增加。同时,在对照组小鼠提取的BMDM极化的过程中,SENP3蛋白表达量明显下降。在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症患者鼻黏膜内检测到不表达SENP3的CD68^(+)CD206^(+)细胞数量显著多于表达SENP3的CD68^(+)CD206^(+)细胞。结论在嗜酸性粒细胞浸润性鼻黏膜炎症中,巨噬细胞SENP3表达的下调促进替代激活巨噬细胞的极化。

膀胱癌患者癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达与疾病进展及复发的关系

目的:探讨膀胱癌患者癌组织纤蛋白3(Fibulin-3)、SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)、核受体辅激活因子1(NCOA1)表达与疾病进展及复发的关系。方法:取104例膀胱癌患者癌组织和癌旁组织各104份,免疫组化法检测Fibulin-3、SENP1及NCOA1表达情况,分析其与患者临床特征的关系;随访3年记录疾病复发情况,并进行Kaplan-Meier生存分析。结果:膀胱癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性率高于癌旁组织(P<0.05);不同TNM分期、病理分级、浸润深度及淋巴结转移情况患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05);Logistic回归分析显示,Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达情况与TNM分期、病理分级、淋巴结转移、浸润深度有关(P<0.05);Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性患者3年无进展生存率低于表达阴性患者(P<0.05)。结论:膀胱癌患者癌组织Fibulin-3、SENP1、NCOA1表达阳性率升高,且与肿瘤进展及复发密切相关,可为临床诊治及预后评估提供重要指导。

SENP3在疾病发生发展中作用的研究进展

小泛素样修饰蛋白(SUMO)特异性蛋白酶(SENP)能介导SUMO前体加工和去SUMO化修饰,是细胞内SUMO稳态维持的核心调控因子。SENP3是SENP家族成员之一,分布于核仁并优先催化靶蛋白的去SUMO2/3修饰;通过与靶蛋白结合并去SUMO化靶蛋白调节多种胞内蛋白功能。一旦SENP3的表达异常,便会引发一系列细胞异常活动,最终导致疾病的发生发展。本文对SENP3在疾病中的功能研究进展做一综述。

HDAC2磷酸化区域突变体的构建及其对小鼠成纤维细胞增殖的影响

目的应用片段缺失突变技术鉴定HDAC2自身磷酸化对其Sumo-E3连接酶活性及蛋白质翻译的影响。方法以前期获得的鼠源性HDAC2Sumo-E3连接酶结构域基因片段为模板,设计片段缺失突变引物,经长片段重叠延伸PCR技术扩增获得片段缺失突变基因片段,后于Top10大肠杆菌中自然连接扩增获得pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3连接酶磷酸化结构域缺失突变的真核表达载体。然后将载体转染于L929成纤维细胞瞬时过表达突变基因,再经翻译反应性荧光素酶报告基因实验和Western-blot鉴定HDAC2自身磷酸化修饰对Sumo-E3连接酶介导的报告基因和靶蛋白质表达的影响。最后通过MTT实验检测HDAC2自身磷酸化修饰对其Sumo-E3连接酶介导的L929细胞增殖的影响。结果成功构建获得磷酸化修饰完全缺失的HDAC2片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3(DEL 394-424AA)。LUC报告基因检测结果显示,DEL 394-424AA片段缺失突变体促进LUC翻译是对照组的4.24倍,且能显著促进靶蛋白ODC和c-Myc的表达,以及L929小鼠成纤维细胞的增殖效应。结论 HDAC2自身磷酸化修饰对HDAC2Sumo-E3连接酶活性及其调节的蛋白质翻译和细胞增殖作用起负性调节作用。

大鼠PIAS3蛋白表达、纯化及生物信息学分析

[目的]构建大鼠His-PIAS3真核表达载体,将His-PIAS3于体外进行表达纯化,并对PIAS3进行生物信息学分析。[方法]采用分子克隆构建His-PIAS3-pcDNA3.1真核表达载体,之后转染入HEK293细胞进行表达,考马斯亮蓝染色检测整体蛋白变化,免疫印迹鉴定His-PIAS3蛋白表达及细胞整体蛋白SUMO化,镍柱纯化His-PIAS3蛋白。生物信息学方法分析大鼠PIAS3蛋白的理化性质、亲疏水性、二级结构及序列的保守性。[结果]His-PIAS3目的基因扩增成功,且亚克隆入pcDNA3.1载体;和空载体组相比,转染His-PIAS3-pcDNA3.1组PIAS3蛋白表达水平明显增加,且整体蛋白的SUMO化水平显著升高;镍柱纯化可获得较高纯度的His-PIAS3蛋白。生物信息学结果显示,大鼠PIAS3蛋白包含628个氨基酸残基,分子量为68.3 kDa,理论等电点为8.05,亲水性平均值为-0.242;PIAS3主要定位于膜内;PIAS3蛋白的二级结构主要由18.79%α-螺旋、13.69%延伸链和67.52%无规卷曲组成;不同物种间pias3序列相似性均在70%以上。[结论]His-PIAS3真核表达载体构建成功;His-PIAS3可在HEK293细胞中高效表达,具有较高酶活性;获得较高纯度His-PIAS3蛋白;PIAS3主要定位于核内,为碱性、亲水性不稳定蛋白,具有高度保守性。

多囊卵巢综合征中高雄激素诱导的颗粒细胞自噬激活作用

目的探讨高雄激素睾酮(testosterone)对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者卵巢颗粒细胞自噬的影响。方法分离培养卵巢功能正常的不孕患者(对照组)及PCOS不孕患者(PCOS组)的卵巢颗粒细胞,分别用10μmol/L睾酮处理24 h;将人卵巢颗粒细胞株KGN培养至3×10^(5)个,分别进行小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及小泛素样修饰物(small ubiquitin-like modifier,SUMO)特异肽酶3(SUMO specific peptidase 3,SENP3)质粒转染;RT-PCR法检测SENP3基因mRNA转录水平,Western blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及SENP3蛋白表达水平。结果与对照组比较,PCOS组卵巢颗粒细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高(P <0.01),P62蛋白表达水平显著降低(P <0.01);两组患者卵巢颗粒细胞经睾酮处理后,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著升高(P均<0.05),P62蛋白表达水平显著降低(P均<0.05)。与对照组比较,PCOS组卵巢颗粒细胞中SENP3 mRNA转录及蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05)。KGN细胞经siRNA干扰,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平上调(P <0.01),P62蛋白表达水平下降(P <0.05);KGN细胞经SENP3质粒转染,LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平无明显变化(P> 0.05),P62蛋白表达水平上调(P <0.01)。PCOS组卵巢颗粒细胞经睾酮处理后,SENP3蛋白表达水平显著下降(P <0.05)。结论PCOS患者颗粒细胞有一定程度的自噬激活,且高雄激素参与了PCOS患者颗粒细胞的自噬激活过程,其作用机制可能与高雄激素抑制颗粒细胞中SENP3蛋白表达有关。