UBC9介导SUMO化修饰在同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡中的作用研究

目的探讨泛素结合酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9,UBC9)介导SUMO化修饰在同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡中的作用。方法首先采用细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)法和Western blot检测不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L)同型半胱氨酸对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的活力及焦亡的影响;采用Western blot检测不同组细胞中UBC9、SUMO化修饰蛋白SUMO-1、炎症因子IL-1β的表达水平;qRT-PCR检测干扰前后UBC9的mRNA表达,同时检测干扰UBC9后,UBC9、焦亡相关蛋白、IL-1β及SUMO-1相关表达。结果当采用100μmol/L的Hcy刺激后,巨噬细胞的活力影响最小且焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1表达最明显(P<0.001);与Control组相比,Hcy组IL-1β的表达水平升高(P<0.01),SUMO-1表达升高(P<0.01);与Control组相比,Hcy组中UBC9蛋白水平及mRNA水平表达均增高(P<0.05);转染si-UBC9后,与si-NC+Hcy组相比,si-UBC9+Hcy组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、UBC9、SUMO-1表达降低(P<0.01)。结论同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡的发生,其机制与上调泛素结合酶9发生SUMO化修饰有关。

2型糖尿病患者血清SUMO1水平与高甘油三酯血症相关性研究

目的·探究2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者血清小泛素样修饰分子1(small ubiquitin-like modifier-1,SUMO1)水平与高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)之间的相关性。方法·选取2020年9月至2021年3月在上海交通大学医学院附属新华医院内分泌科门诊就诊的新诊断为2型糖尿病的患者共239例,其中T2DM合并HTG组患者92例,T2DM不合并HTG组患者147例。收集患者基本信息和实验室指标,分析2组患者血清SUMO1水平的差异。采用二元Logistic回归分析T2DM合并HTG的影响因素,采用多元线性逐步回归分析血清SUMO1水平对T2DM合并HTG风险的影响。结果·与T2DM不合并HTG的患者相比,T2DM合并HTG患者的血清SUMO1水平明显升高(1114.99 pg/mL vs 902.43 pg/mL,P<0.001)。二元Logistic回归分析提示血清SUMO1水平(OR=1.527,95%CI 1.200~1.943)、糖化血红蛋白(OR=1.202,95%CI 1.038~1.391)、血尿酸(OR=1.006,95%CI 1.003~1.010)是T2DM合并HTG的独立危险因素。将血清SUMO1水平按照四分位分层,校正各种混杂因素后,以Q1层作为对照,Q4层T2DM合并HTG的风险是Q1层的2.707倍(95%CI 1.231~5.951)。多元线性逐步回归分析发现女性、腰臀比、甘油三酯、血肌酐是血清SUMO1水平升高的独立危险因素。结论·T2DM合并HTG患者血清SUMO1水平显著高于不合并HTG患者,血清SUMO1水平是T2DM合并HTG的独立危险因素。

小泛素样修饰(SUMO)与肿瘤发生发展的机制研究进展

泛素样小分子修饰物(SUMO)是一种可逆的翻译后修饰。作为一种重要的分子调控机制,它在DNA损伤修复、机体免疫应答、癌变、调控细胞周期和细胞凋亡过程中发挥着关键作用。SUMO广泛参与肿瘤发生、癌细胞增殖和转移,但其导致恶性肿瘤发生的分子调控机制尚未完全明确。深入探究SUMO修饰在各类癌症发生中的分子机制,将为恶性肿瘤的诊断、治疗及预防提供新的分子靶点。该文对SUMO的修饰过程进行了简要概括,并对SUMO蛋白在多种癌症中的作用进行了综述。

去SUMO化酶SENP5的表达、纯化、活性测定及复合物重组

SENP5参与转录调控、蛋白质稳态、DNA修复和细胞分裂等重要生命过程,与癌症、发育缺陷和神经变性等疾病密切相关.SENP5包含N端的无规则卷曲和C端的催化结构域.研究对SENP5的催化结构域(SENP5CD)进行了表达和纯化.C末端水解活性实验表明SENP5CD对SUMO2前体(pSUMO2)的切割活性大于SUMO1前体(pSUMO1).分子筛实验证明,SENP5能够与SUMO1和SUMO2的前体、RanGap1-SUMO1和RanGap1-SUMO2形成稳定的复合物.实验构建了SUMO1-PA和SUMO2-PA活性探针,这2种活性探针都能与SENP5CD反应形成共价结合的复合物.通过比较AlphaFold预测的SENP5CD-pSUMO1和SENP5CD-pSUMO2复合物结构,发现pSUMO2与SENP5CD的结合比pSUMO1更紧密.研究表达、纯化了SENP5,鉴定了酶活性,获得了SENP5CD与底物的复合物,为进一步研究SENP5奠定了基础.

细粒棘球蚴感染诱导巨噬细胞Sp3的SUMO化修饰

目的探究Sp3的SUMO化修饰在细粒棘球蚴感染的巨噬细胞中的作用。方法体内随机分为对照组(PBS)与实验组(肝被膜下接种原头节悬液),免疫组化检测小鼠肝脏SUMO1、UBC9表达;免疫荧光双染检测巨噬细胞CD206和SUMO1荧光共定位。体外RAW264.7巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+EgCF组,12 h收集细胞qRTPCR检测SUMO1、UBC9、IL-6、IL-10 mRNA表达;免疫印迹法检测SUMO1、UBC9的蛋白水平;COIP检测SUMO1与Sp3的互作。结果体内实验:与对照组比,实验组包囊近端肝脏组织炎性区细胞高表达SUMO1、UBC9蛋白,CD206+巨噬细胞与SUMO1共定位。体外实验:EgCF刺激RAW264.7细胞炎症模型促进IL-10表达,抑制IL-6表达,诱导SUMO1、UBC9 mRNA、蛋白表达,诱导Sp3的SUMO化。结论细粒棘球蚴感染诱导巨噬细胞Sp3的SUMO化修饰。

SENP1在SPOP去SUMO化修饰中的作用研究

目的:研究小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰对SPOP(speckle type BTB/POZ protein)蛋白水平和细胞定位的影响,并尝试在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中探讨SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific proteases 1,SENP1)和SPOP之间的相关性。方法:利用野生型(wild type,WT)和Senp1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞研究Senp1对Spop蛋白水平和细胞定位的影响,并通过比较外源WT-Spop和Spop的SUMO修饰位点突变体的蛋白表达量,进一步确认SUMO修饰对Spop蛋白水平的影响。后续通过邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)研究WT-Spop及其SUMO修饰位点突变体与SUMO1的结合能力。最后通过ccRCC患者的RNA表达数据和ccRCC细胞系探讨SENP1和SPOP在ccRCC中的相关性。结果:Senp1敲除下调小鼠胚胎成纤维细胞中Spop的蛋白量和稳定性,但不影响其细胞核定位。突变Spop的SUMO修饰位点后,其与Sumo1的结合能力下降,蛋白量也有所降低。SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。结论:Senp1通过去SUMO化修饰稳定Spop蛋白,SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。

CtBP1 SUMO化修饰的分子机制研究

目的在体外重组表达、纯化CtBP1发生SUMO化修饰时参与反应的各个蛋白:CtBP1(底物)、SUMO1(SUMO蛋白)、Ubc9(E2结合酶)和PC2(E3连接酶),体外组装CtBP1 SUMO化修饰复合体CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2,通过结构解析捕捉CtBP1发生SUMO化修饰的中间状态,阐明CtBP1 SUMO化修饰的分子机制。方法通过pRSFDuet-1载体构建人源CtBP1、SUMO1、Ubc9、PC2表达质粒,系统表达纯化各蛋白组分,并通过分子筛检测并优化各个蛋白的状态,以及CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2复合体的形成,通过单颗粒冷冻电镜解析复合体结构。结果通过原核表达系统成功表达并纯化获得了参与CtBP1 SUMO化反应复合体中的各个蛋白CtBP1、SUMO1、Ubc9与PC2,获得了CtBP1 SUMO化修饰复合体,通过负染和冷冻电镜的样品优化初步获得了CtBP1 SUMO化修饰复合体的冷冻电镜结构。结论成功获得了CtBP1 SUMO化反应中间状态CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2复合体蛋白以及初步的冷冻电镜结构,为阐明CtBP1发生SUMO化修饰的分子机制奠定了重要基础。

SUMO化修饰精细调控内皮HEY1在血管生成中的作用

HEY1(hairy/enhancer of split related with YRPW motif 1)是在内皮生成中发挥重要作用的一种经典转录抑制因子,但HEY1的具体作用机制尚不清楚。SUMO化修饰(SUMOylation)是一种翻译后修饰过程,在血管发育和组织动态调节可能具有潜在作用。首先,作者通过免疫沉淀实验发现,K82R、K292R、K90R赖氨酸残基的缺失会抑制HEY1的SUMO化修饰,对应的三重突变体HEY1-3KR几乎没有SUMO化修饰。

基于SUMO软件的公路作业区行车风险仿真分析

文章基于SUMO仿真软件,参照《公路养护安全作业规程》(JTG H30—2015)关于作业区各个区域长度的设定要求,在SUMO中构建仿真环境。试验工况为:封闭右侧单车道。结合实际工况,交通量和大车比例均分为三种情况,采用TTC和DRAC作为评价指标。实验结果表明,在任意工况和任意交通量条件下,车辆进入上游过渡区所形成的“TTC风险墙”、“DRAC风险墙”位置均随着大车比例的上升而提前,其相应厚度也同时增加。

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。

蛋白质SUMO化修饰研究进展

SUMO(small ubiquitin-related modifier)是类泛素蛋白家族的重要成员之一,可与多种蛋白结合发挥相应的功能,其分子结构及SUMO化反应途径都与泛素类似,但二者功能完全不同。SUMO化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性及信号转导等多种细胞内活动,是一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式。SUMO化修饰功能的失调可能导致某些疾病的发生。

SUMO融合系统高效表达可溶性鼠源FGF-21及其活性的研究

利用SUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达鼠源成纤维细胞生长因子(FGF-21)成熟蛋白,并研究其调节血糖的功能。将鼠源FGF-21成熟蛋白基因亚克隆至SUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。将3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞,经微量化的GOD-POD法检测培养基中葡萄糖含量,统计学分析葡萄糖消耗率。结果表明,在SUMO表达体系中鼠源FGF-21成熟蛋白基因以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效地切割,获得纯度较高的成熟蛋白。与未经处理的脂肪细胞对照组相比,经鼠源FGF-21成熟蛋白处理后脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加,残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少;两样本比较的t检验,P<0.001,差异极显著。

SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定

利用PCR技术人工合成编码酿酒酵母泛素样特异性蛋白酶1(Ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段Ulp1p,并连接到大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-Ulp1p。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。经IPTG诱导4h后,SDS-PAGE结果显示,Ulp1p为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的50.8%。通过Ni-NTA凝胶亲和层析和G-25凝胶层析联用可以获得纯度大于95%的Ulp1p。Western blotting分析表明,Ulp1p能与6xHis抗体产生免疫反应。以重组蛋白SUMO-hEGF(人表皮生长因子)和GST-SUMO-MT(金属硫蛋白)为底物进行酶切分析,结果显示,Ulp1p能特异性水解这两种SUMO融合蛋白,其比活为1.386×104U/mg。

基于SUMO的概念语义相似度研究

SUMO(建议上层共享知识本体)是由IEEE标准上层知识本体工作小组所建置的,其目的是发展标准的上层知识本体,这将促进数据互通性、信息搜寻和检索、自动推理和自然语言处理。基于该共享知识本体,提出了一种计算两概念语义相似度的方法。根据该方法实现了一个计算程序模块,并将计算结果同人类的主观判断进行了比较,验证了该方法的有效性。该研究工作可以在面向W eb的知识检索领域中得到应用,还可以为本体的相关研究提供一定的理论基础。

Sumo分子伴侣与富含二硫键的抗真菌肽Drs基因的融合有助于其可溶性表达

利用PCR引物延伸的方法合成了分子伴侣Sumo和抗真菌肽Drosomycin的融合基因,将其插入到表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-3c-SD,并转化至大肠杆茵BL21(DE3)中。筛选重组转化子,进行表达条件的优化和表达产物的可溶性分析。结果表明在30℃条件下,用0.5mmol/LIPTG诱导3h后,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的22%,其中可溶性蛋白超过了目的蛋白的80%。经过Ni-NTA纯化后,融合蛋白的纯度可达95%以上。抑菌实验表明,该融合蛋白对白僵菌(Beauveria bassiana)具有一定的抑真菌活性。证实了使用分子伴侣Sumo融合表达对具有多个二硫键的小分子多肽的表达是非常有效的。

SUMO在转录中的抑制作用

许多调控基因转录的重要蛋白质能被SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰,这些蛋白质包括转录因子,转录辅助因子和染色质修饰酶.SUMO化修饰对底物蛋白的活性产生影响,在大多数情况下,与转录活性的抑制有关.最近,对SUMO化调控转录的机制有了新的认识,认为SUMO化的一个重要作用是促进转录因子与转录抑制因子之间的相互作用.另一方面,已经发现转录共抑制因子HDAC(组蛋白去乙酰化酶)可以作为SUMO化的底物、效应因子和调控因子,说明乙酰化和SUMO化之间复杂的相互作用对基因转录调控起着非常重要的作用.

基于SUMO的应急预案本体

构建应急预案本体,可提供对该领域知识一致的共同理解,实现应急管理中多部门的业务协同与信息共享。为此,采用当前比较成熟的本体工程方法,对应急预案相关概念、属性及其关系进行深入分析,抽取领域知识并提炼出业务术语及相互之间的关系。以权威、通用的SUMO为上位本体,运用Prot（？）g（？） 3.1工具,分为上位本体和领域本体两层构建了应急预案本体模型,并基于OWL语言从不同层次对相关的属性、限制、公理进行规范描述,最后采用具有一定影响力的本体评价系统,分别从定性和定量两个角度对所建本体进行评价。

植物SUMO化修饰及其生物学功能

SUMO化修饰是细胞内蛋白质功能调节的重要方式之一。植物中的SUMO化修饰途径由SUMO分子和SUMO化酶系组成。SUMO化修饰是一个可逆的动态过程。SUMO前体蛋白在SUMO特异性蛋白酶的作用下成熟,随后通过SUMO活化酶、SUMO结合酶和SUMO连接酶将靶蛋白SUMO化,最后SUMO特异性蛋白酶将SUMO与靶蛋白分离,重新进入SUMO化循环。初步研究表明,植物SUMO化修饰参与植物花期调控、激素信号转导、抗病防御以及逆境应答等生理过程。

SUMO E3连接酶介导雄激素受体的转录促进乳腺癌他莫昔芬耐药

目的:探讨SUMO化的雄激素受体(androgen receptor,AR)参与他莫昔芬耐药的机制以及SUMO抑制剂银杏酸在耐药中的作用。方法:通过Real-Time PCR检测亲本细胞MCF-7W和耐药细胞MCF-7R中AR mRNA水平,Western blot检测MCF-7W和MCF-7R细胞中AR蛋白水平以及SUMO水平,免疫沉淀和染色质免疫沉淀(CB/IP)检测MCF-7R细胞染色质中AR与SUMO E3连接酶PIAS1、HSP27相互作用,荧光报告基因实验检测SUMO化AR的转录活性,CCK-8法、台盼蓝拒染法分别检测细胞活性和细胞活力。结果:MCF-7R细胞中AR的mRNA和蛋白表达水平表达量明显高于MCF-W7细胞(P<0.05),并且MCF-7R细胞中显示高SUMO化的AR;进一步研究发现MCF-7R细胞染色质中AR与SUMO E3连接酶PIAS1、HSP27存在明显相互作用,即SUMO化的AR是由E3连接酶修饰的;双荧光素酶报告基因试剂盒检测发现雄激素R1881呈浓度依赖性增强SUMO化的AR的转录活性;与单用银杏酸相比,10μmol/L银杏酸联合10μmol/L恩杂鲁胺治疗处理MCF-7R细胞3 d后,细胞数明显降低,细胞死亡数明显增加(P<0.05)。结论:他莫昔芬耐药机制可能是由于高活性SUMO化的AR使AR转录增强、活性增高,SUMO抑制剂银杏酸联合AR拮抗剂恩杂鲁胺可成为治疗他莫昔芬耐药的新策略。

SUMO-1基因在肝癌中的表达及意义

目的研究肝癌传代细胞、肝癌标本及癌旁肝组织中SUMO-1基因的表达及意义。方法采用RT-PCR、Westernblot方法在mRNA及蛋白水平检测肝癌传代细胞、肝癌标本及癌旁肝组织中SUMO-1基因的表达。结果在mRNA及蛋白水平,SUMO-1基因在肝癌传代细胞SMMC-7721、Hep3B、HepG2及肝癌标本中均明显高表达,而癌旁肝组织中SUMO-1基因明显低表达,肝癌组织和癌旁肝组织中SUMO-1表达差异有统计学意义(P<0.001)。结论SUMO-1基因在肝癌中高表达,SUMO-1可能为肝癌诊断和治疗中的一个靶点。