鬼臼苦素抗Ph^+急性淋巴细胞白血病细胞Sup-B15的作用及其机制

目的探讨鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)对Ph^+急性淋巴细胞白血病(Ph^+ALL)细胞Sup-B15的作用及其分子调控机制,为将PPP开发成为治疗Ph^+ALL药物提供理论依据。方法 MTS法检测PPP和格列卫(IM)对Sup-B15细胞增殖的影响;流式细胞术检测PPP和IM对Sup-B15细胞周期的影响;Western blot检测PPP对细胞增殖和周期相关蛋白表达,以及对IGF1R蛋白磷酸化和表达的影响。结果PPP和IM均呈时间和剂量依赖性关系抑制Sup-B15细胞的增殖,且相同剂量下PPP对细胞增殖的抑制作用均强于IM;PPP处理细胞12 h和24 h后G2/M期细胞比例显著升高,而S期细胞比例则相应减少;PPP能够上调p53和cyclin B1蛋白的表达以及抑制p21和c-myc蛋白的表达,但对IGF1R总蛋白表达水平和磷酸化水平均无明显影响。结论 PPP能有效抑制Sup-B15细胞增殖和诱导细胞发生G2/M期阻滞,其机制与上调p53和cyclin B1蛋白表达以及抑制p21和c-myc蛋白表达相关。

BRD4拮抗剂GSK525762A对SUP-B15细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制

目的:探讨BRD4拮抗剂GSK525762A对费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞株增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法:选择不同浓度的GSK525762A处理SUP-B15细胞,采用CCK-8法检测细胞活力并绘制增殖抑制曲线,应用Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测C-MYC、CDK6、BCL2的转录变化。结果:GSK525762A能显著抑制SUP-B15细胞增殖,且具有量-效关系和时-效关系。GSK525762A能够诱导SUP-B15细胞凋亡;GSK525762A能够使抑凋亡基因C-MYC、CDK6、BCL2表达减低。结论:GSK525762A能抑制SUP-B15细胞增殖并诱导其凋亡,其机制主要与下调C-MYC、CDK6、BCL2转录有关。

JQ1诱导SUP-B15细胞凋亡的Notch1通路机制研究

目的:本研究观察布罗莫结构域抑制剂JQ1诱导人Ph阳性急性淋巴细胞白血病细胞株(SUP-B15)凋亡的Notch1通路可能机制。方法:用不同浓度JQ1在不同时期处理SUP-B15细胞,用四甲基偶氮唑蓝试验(MTT法)检测细胞增殖情况;用流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR法检测MIS2、Notch1、Hes1、BCR-ABL mRNA的表达水平。结果:JQ1在0-4μmol/L的浓度范围内能抑制SUP-B15细胞的生长,并呈现剂量-时间依赖性;JQ1在1、2、4μmol/L处理SUP-B15细胞48 h后,诱导细胞S期阻滞,并呈剂量依赖性,与同时间对照组比较有统计学差异(P<0.05);与同时间对照组相比,JQ1能够降低MIS2、Notch1、Hes1、BCR-ABL mRNA的表达。结论:JQ1可以有效抑制SUP-B15细胞生长增殖,而Notch1通路凋亡途径很可能是JQ1促进Ph+ALL细胞凋亡的多途径之一。

携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体的构建及其在Sup-B15白血病细胞株的表达

本研究旨在构建携带人血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)基因的重组慢病毒载体及探讨VE-cadherin蛋白在Sup-B15细胞中的表达。采用RT-PCR扩增人VE-cadherin基因并克隆至pCR-Blunt载体。将VE-cadherinDNA片段连入慢病毒转移质粒pLB,生成重组慢病毒质粒pLB-VEC。用三质粒共转染法包装慢病毒,重组慢病毒感染Sup-B15细胞,在光学显微镜下观察细胞状态,用流式细胞术及Western blot法鉴定VE-cadherin蛋白表达。结果表明,成功扩增出人VE-cadherinDNA片段并克隆至pCR-Blunt载体;亚克隆构建慢病毒载体pLB-VEC。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒,体外可有效感染Sup-B15细胞。感染后细胞发生明显的形态改变,流式细胞术及Western blot检测到VE-cadherin蛋白表达。结论 :成功构建携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体pLB-VEC,并可在Sup-B15白血病细胞株获得有效的表达。

家蝇幼虫抗菌肽粗提物与8种纯化物对SUP-B15细胞增殖抑制和诱导的凋亡作用

将家蝇三龄幼虫抗菌肽粗提物利用反相高效液相色谱仪（RP—HPLC）进行分离纯化，得到8种与对照组有差异的蛋白分别命名为I1、12、13、14、G1、G2、G3、G4组。通过CCK-8试剂盒检测发现，其中有4种蛋白及粗提物（E0组）对sup-b15细胞有增殖抑制作用，生存率均值分别为11：0．714、12：0．785、14：0．641、G2：0．686、E0：0．561。采用流式细胞仪检测其诱导凋亡的效果，其凋亡率均值分别为11：16．73、12：9．79、14：18．60、G2：11．85、E0：35．94。对比发现，粗提物（E0）对sup—b15细胞的抑制率明显高于纯化物，证明粗提物较纯化物对肿瘤细胞抑杀作用更为明显，间接的说明各种纯化蛋白之间具有某些协同作用。

雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15的增殖、凋亡与自噬的影响

目的探讨雷帕霉素(RAPA)对人急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞的增殖、自噬与凋亡的影响。方法常规方法复苏、传代培养SUP-B15细胞,设置空白对照组(正常培养)、雷帕霉素处理组。处理24、48、72 h后收集细胞,采用MTT比色法检测细胞的活性和增殖能力;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;吖啶橙单染及透射电镜观察细胞自噬现象。结果 MTT检测结果显示,RAPA对SUP-B15细胞增殖有较强抑制作用(IC50=18.174 nmol/L),且抑制作用随药物剂量增加和作用时间延长而增强;流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,不同浓度RA-PA作用可诱导SUP-B15细胞凋亡,作用48、72 h细胞凋亡较24 h时明显;RAPA作用48 h时的细胞凋亡随药物浓度增大而增多,72 h时高剂量药物(50、100 nmol/L)引起的细胞凋亡较低剂量药物(10、20 nmol/L)少;吖啶橙单染荧光显微镜观察显示,与空白对照组相比,雷帕霉素处理组细胞胞质中出现较多红色斑点的酸性膜泡(即自噬小体),且随药物浓度增大红色斑点增多;透射电镜观察结果显示,雷帕霉素处理组细胞胞质内可见较多自噬小体和自噬溶酶体,线粒体内嵴明显紊乱,细胞核不规则,染色质边缘化。结论雷帕霉素对SUP-B15细胞生长有较强的抑制作用;雷帕霉素可诱导SUP-B15细胞发生自噬和凋亡,且自噬的发生先于凋亡出现,一定强度的自噬活性可诱导细胞凋亡增加。

多药耐药基因MDR1在Ph(+)急性淋巴细胞白血病伊马替尼耐药细胞株SUP-B15/RI耐药形成中的作用

目的研究多药耐药基因MDR1在Ph(+)急性淋巴细胞白血病〔Ph(+)ALL〕伊马替尼(IM)耐药细胞株SUP-B15/RI耐药机制中的作用。方法 RT-PCR技术检测敏感细胞株SUP-B15和IM耐药细胞株SUP-B15/RI MDR1mRNA表达,改良MTT法测定IM、柔红霉素(DNR)、长春新碱(VCR)、依托泊甙(VP-16)单药及联合维拉帕米作用于SUP-B15细胞和SUP-B15/RI细胞72h后增殖活性的改变,计算抑制率为50%时的药物浓度(IC50),DNR药物外排实验检测MDR1表达产物P-gp功能。结果 MDR1基因在SUP-B15/RI中的表达是敏感细胞SUP-B15的(2.02±0.04)倍(P<0.05)。IM、DNR、VCR、VP-16单药作用于SUP-B15/RI细胞的IC50值较SUP-B15细胞增高(P<0.05),相对耐药倍数(RF)分别为(20.52±2.34)、(10.33±1.88)、(9.78±1.27)、(3.84±0.69)倍。IM、DNR、VCR、VP-16与维拉帕米联合作用于SUP-B15/RI细胞后IC50值较单药时降低(P<0.05),耐药逆转倍数分别为(1.44±0.43)、(3.20±0.17)、(1.44±0.12)、(1.33±0.14)。P-gp蛋白功能在SUP-B15/RI细胞强于SUP-B15细胞,DNR泵出率分别为10.27%、3.43%。结论 MDR1基因在SUP-B15/RI细胞中表达增加,其表达产物P-gp功能增强,P-gp抑制剂维拉帕米可以部分逆转IM耐药。说明MDR1参与SUP-B15/RI细胞IM耐药机制的形成。

前B急性淋巴细胞白血病细胞Sup-B15对化疗药物敏感性及侵袭力的研究

目的 探讨Ik6阳性表达的前B急性淋巴细胞白血病细胞Sup-B15对化疗药物的敏感性及侵袭力,并与国内常用的细胞模型Nalm-6进行比较研究.方法 采用巢式反转录-PCR及Western blot法检测细胞Ik6的表达;应用CCK-8法检测化疗药物长春新碱（VCR）、柔红霉素（DNR）、左旋门冬酰胺酶（L-Asp）及地塞米松（Dex）对细胞增殖的影响;采用Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭力;应用实时荧光定量PCR法检测血管新生相关基因VEGF、Flt-1、PlGF、Ang1、Ang2和IGF-1的表达.结果 Nalm-6细胞中未检测到Ik6的表达.相比较于Nalm-6细胞,Sup-B15细胞生长速度较慢.4种化疗药物均能以时间和剂量依赖方式抑制两细胞的增殖,Sup-B15细胞对DNR、L-Asp和Dex更敏感,IC50分别是Nalm-6细胞的9.5倍、1.1倍和1.5倍,但是对VCR的敏感性不及Nalm-6细胞.Transwell小室实验显示迁移或侵袭到下室的Sup-B15细胞较少.血管新生相关基因在Sup-B15细胞中相对低表达.结论 Sup-B15细胞相比较于Nalm-6细胞,是一种对化疗药物更敏感、侵袭力较弱的前B急性淋巴细胞系.

4'-羟基汉黄芩素对急性淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的作用研究

目的:研究4'-羟基汉黄芩素(4'-hydroxywogonin)对急性淋巴细胞白血病细胞株SUP-B15和Jurkat细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养SUP-B15和Jurkat细胞,经不同浓度的4'-羟基汉黄芩素处理细胞后,用CCK8法测定4'-羟基汉黄芩素对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测BCL-2,cleaved caspase-3,C-MYC等蛋白表达情况。结果:4'-羟基汉黄芩素呈剂量依赖性抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖(r=0.78,r=0.89),24 h IC_(50)分别为(6.32±0.53)μg/ml,(12.04±0.42)μg/ml。在梯度药物浓度下,细胞凋亡率增高。Westwrn blot检测结果显示,4'-羟基汉黄芩素使凋亡相关蛋白BCL-2表达下调(P<0.01);cleaved caspase-3表达上调(P<0.01);细胞增殖相关蛋白C-MYC表达下调(P<0.01)。结论:4'-羟基汉黄芩素可通过抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖及诱导其凋亡而发挥抗肿瘤作用,其机制可能与下调BCL-2,C-MYC表达,上调cleaved caspase-3蛋白表达有关。

CAV1基因在五种白血病细胞中的表达

目的检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者原代肿瘤细胞、SUP-B15细胞、HL-60细胞、K562细胞、THP-1细胞中CAV1的表达情况。方法收集五种肿瘤细胞及正常人白细胞(WBC),使用QRT-PCR、Western印迹法方法分别检测各组细胞中CAV1 mRNA的相对含量及CAV1蛋白表达情况。结果与WBC相比,各肿瘤细胞中CAV1 mRNA均为低表达,表达量由低到高依次为HL-60(0.097±0.02)、CLL(0.1±0.02)、THP-1(0.101±0.02)、K562(0.127±0.04)、SUP-B15(0.311±0.07);与WBC相比,各肿瘤细胞中CAV1蛋白表达均下调。结论与正常人WBC相比,CLL原代肿瘤细胞、HL-60、THP-1、K562、SUP-B15细胞中CAV1 mRNA及蛋白表达均降低,CAV1表达的异常可能出现在转录之前。

依鲁替尼与达沙替尼对急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制及其机制实验研究

目的:研究Btk抑制剂PCI-32765(依鲁替尼)和酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂Dasatinib(达沙替尼)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞(Sup-B15、RS4;11)增殖、凋亡的影响,为其用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗提供实验依据。方法:PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药处理Sup-B15与RS4;11细胞后,用CCK-8法检测细胞的凋亡,刘氏染色法观察对细胞形态变化,Western blot法检测PCI-32765和Dasatinib对Btk上下游信号分子表达及活性的影响。结果:PCI-32765对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,Sup-B15细胞对其敏感性高于RS4;11,IC_(50)值分别为3和8μmol/L(P<0.05)。Dasatinib对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用也呈剂量依赖性,IC50值分别为5μmol/L和5 nmol/L,相差1 000倍(P<0.01)。Dasatinib与PCI-32765联用后,增殖抑制作用明显增强(P<0.05)。PCI-32765和Dasatinib分别作用RS4;11和Sup-B15细胞8、12、24、36、48和72 h,PCI-32765与Dasatinib单药组及联合用药组的细胞存活率均逐渐降低,且两药具有协同作用,呈时间依赖性。PCI-32765或/和Dasatinib处理的RS4;11和Sup-B15细胞体积缩小,细胞质密度增加,核固缩、核偏位、核碎裂,但小剂量Dasatinib单药对RS4;11细胞凋亡促进不明显,联合用药组凋亡细胞增多。PCI-32765或/和Dasatinib处理SupB15细胞BCR-ABL、Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关;RS4;11细胞Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关。结论:PCI-32765或Dasatinib均可明显抑制Sup-B15和RS4;11细胞增殖,诱导其凋亡,且有协同作用。其作用机制可能与通过活化B细胞受体(B cell receptor,BCR)信号通路、促进细胞凋亡有关。

c-myc抑制剂10058-F4对Ph^+ALL细胞凋亡的影响及相关机制研究

目的探讨c-myc抑制剂10058-F4对Ph^+急性淋巴细胞白血病(Ph^+ALL)细胞Sup-B15的作用及其分子调控机制,为将10058-F4开发成为治疗Ph^+ALL药物提供理论依据。方法流式细胞术检测10058-F4对Sup-B15细胞凋亡和细胞周期的影响,以及对Ph^+和Ph^-的原代ALL细胞凋亡和坏死的影响;Western blotting检测10058-F4对c-myc及其下游调控基因蛋白表达的影响。结果 10058-F4显著地诱导Sup-B15细胞凋亡,但对细胞周期无明显影响;10058-F4分别诱导Ph^+和Ph^-的原代ALL细胞发生明显的凋亡和坏死。40μmol/L的10058-F4显著抑制c-myc、Bcl-xl、Mcl-1和Bcl-abl的蛋白表达,但对Bcl-2、Bax和p-crkl蛋白表达均无明显影响。阳性对照药物PPP和IM均显著抑制c-myc、Mcl-1和p-crkl蛋白的表达,同时,PPP也明显地抑制Bcl-2蛋白的表达。结论 10058-F4能有效促进Ph^+的Sup-B15细胞系和原代细胞的凋亡,其机制与抑制c-myc及其调控的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达相关。

RNA干扰血管内皮钙黏蛋白表达对Ph＋急性淋巴细胞白血病细胞株Sup—B15甲磺酸伊马替尼敏感性的影响

目的探讨下调Ph＋急性淋巴细胞白血病细胞血管内皮钙黏蛋白（CD144）表达对甲磺酸伊马替尼敏感性的影响及可能的机制。方法通过慢病毒载体介导的RNA干扰（RNAi）沉默急性淋巴细胞白血病株Sup—B15细胞的CD144表达，建立CD144表达稳定下调的细胞株Sup—B15／shVEC。用CCK-8法检测甲磺酸伊马替尼对细胞增殖的影响；用AnnexinV／7一AAD标记，流式细胞术检测细胞凋亡；用流式细胞术检测CD34＋CD38-细胞比例变化；荧光定量PCR检测细胞ALDHImRNA水平；Westernb1ot法检测细胞CD144、CD133、Bcr—ab1、B—catenin表达水平。结果不同浓度甲磺酸伊马替尼对Sup—B15、Sup—B15／shVEC细胞均有增殖抑制作用，其半数抑制浓度（IC50值）分别为25．1、18．7txmo1／L，两组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）。20txmo1／L甲磺酸伊马替尼作用48h，Sup—B15及Sup—B15／shVEC细胞凋亡率分别为（3．03±0．72）％、（13．52±2．06）％，两组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞术检测结果显示Sup—B15细胞CD34＋CD38-细胞率明显高于Sup—B15／shVEC细胞[（2．39±0．28）％对（0．96±0．07）％]，两组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。Sup—B15／shVEC细胞与Sup—B15细胞相比，ALDH1转录水平明显下降（0．043±0．008对0．016±0．003），CD133蛋白、B—catenin总蛋白及核蛋白表达水平也明显下降，而bcr—ab1融合蛋白表达水平无明显变化。结论Sup—B15细胞CD144表达稳定下调后其对甲磺酸伊马替尼敏感性明显增高，该作用可能是通过降低p—catenin蛋白稳定性、减少p—catenin蛋白核转位实现的。

伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株抗肿瘤效应的比较研究

目的比较研究化疗药物伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株K562(髓系白血病细胞株,表达P210蛋白)和SUP-B15(急性淋巴细胞白血病细胞株,表达P190蛋白)的抗肿瘤效应。方法采用MTT法测定不同浓度的伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用72 h后两种细胞株的增殖活性,并计算3种化疗药物对两种细胞株作用的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测不同浓度伊马替尼作用48 h后两种细胞株bcr-abl基因表达的改变。结果①不同浓度伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用K562和SUP-B15细胞株72h,其对细胞株的IC50值分别为(0.286±0.060)μmol/L、(0.303±0.009)μmol/L、(22.127±3.592)nmol/L和(1.387±0.180)μmol/L、(0.117±0.017)μmol/L、(12.35±0.740)nmol/L,提示伊马替尼对K562细胞敏感性明显高于SUP-B15细胞,而柔红霉素对SUP-B15更敏感,硼替佐咪对两种细胞的敏感性无差异;②伊马替尼0、0.35、1.0μmol/L作用48 h后,两株细胞bcr-abl基因表达均无明显变化。结论伊马替尼、柔红霉素、硼替佐咪对Ph(+)细胞株K562和SUP-B15均有较好的抗肿瘤效应,伊马替尼对K562更敏感,而柔红霉素和硼替佐咪对SUP-B15均有较好的抑制作用;短时间伊马替尼作用后不影响bcr-abl基因的表达。

布罗莫结构域4抑制剂jQ1对Ph阳性急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制作用和机制研究

目的观察布罗莫结构域4（brd4）抑制剂JQ1对Ph阳性急性淋巴细胞白血病（Ph＋ALL）细胞株SUP．B15的增殖抑制、凋亡作用及对brd4及其下游基因myc、p53表达的影响，探讨其是否对bcr—ab1有逆转作用。方法采用不同浓度的JQ1处理SUP-B15细胞。四甲基偶氮唑蓝（MTr）法检测细胞的增殖抑制率；AnnexinV—FITC／PI荧光染色流式细胞术检测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR（RT—PCR）法检测bcr-ab1、brd4、myc、p53的mRNA表达。结果不同浓度的JQ1均能抑制SUP-B15细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡，凋亡率较对照组明显增高，并呈时间-剂量依赖性，作用72h半数抑制浓度为1．0μmol／L。同时JQ1可以使bcr—ab1、brd4、myc的mRNA水平下降，而使p53mRNA的水平升高。结论brd4抑制剂JQl可通过下调brd4的表达，影响其下游基因myc及p53的表达，同时逆转bcr-ab1表达，达到抑制Ph＋ALL细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。