SV40 LT抗原介导的蝙蝠胎儿肾细胞永生化

蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。

SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒(AdHu5-SV40LT)转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒(AdHu5-SV40LT)。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建(英文)

目的 构建带有SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体。方法 采用体外重组技术构建带SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,酶切、测序进行鉴定 ,脂质体介导转染PA317包装细胞 ,经G4 18筛选出抗性克隆 ,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV4 0LT抗原基因 ,且为正向插入。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1.3× 10 6CFU/ml。结论 成功构建了含SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒。

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法 利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果 ( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论 成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 。

SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的构建SV40LT基因过表达慢病毒载体,并对其进行慢病毒包装,为建立永生化的uncv小鼠胚胎成纤维细胞奠定基础。方法从293T细胞中获得SV40LT基因,将其克隆到p Lenti-GFP质粒中,构建重组穿梭质粒p Lenti-GFP-SV40LT,测序鉴定后分别将鉴定的阳性p Lenti-GFP-SV40LT和包装质粒p MD2.0G和ps PAX2共转染293T细胞,包装产生慢病毒。结果 SV40LT基因过表达慢病毒载体的构建与包装成功。结论 SV40LT基因过表达慢病毒载体构建与包装的成功为uncv小鼠胚胎成纤维细胞的永生化提供了工具。

SV40-LT基因的原核表达及免疫原性检测

为了获得纯化的SV40-大T抗原(SV40-LT)及其特异性抗体,本研究利用原核表达系统高效表达了SV40大T抗原的高抗原指数区域,然后将纯化的大T抗原免疫试验兔,制备了相应的特异性抗体。经蛋白免疫电泳和ELISA方法检测,结果表明本研究获得的原核表达产物,不仅具有较好的免疫原性,而且能够诱导试验兔产生较高的抗体水平(抗体效价为1∶6 400)。

慢病毒载体介导SV40LT致人脐静脉内皮细胞永生化

为成功分离与鉴定人原代脐静脉内皮细胞,用猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系。将含SV40LT cDNA片段的慢病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养。通过形态、细胞免疫组织化学、RT-PCR及管状成形试验进行原代及转染后细胞形态学和功能学鉴定及检测SV40大T抗原表达。结果SV40LT转染后的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形或短梭状,呈单层铺路石状镶嵌排列。特异性表达Ⅷ因子、KDR、SV40LT表达,并具有管状成型能力。说明成功分离与鉴定永生化的脐静脉内皮细胞系,为后续血管靶向治疗奠定了基础。

SV40LT抗原诱导人源性淋巴细胞恶性转化

目的:研究SV40 Large T(LT)对淋巴细胞转化的影响。方法:将逆转录病毒载体质粒pBabe-SV40LT转入外周血单核细胞。倒置显微镜观察细胞形态变化,蛋白印迹明确LT蛋白表达,流式细胞仪分析膜表面分子的表达,G显代染色体确定核型,生长曲线判别细胞生长状态。软琼脂实验检测细胞恶性变。结果:导入SV40LT后的淋巴细胞形态发生明显改变,由悬浮生长变为贴壁生长。转染细胞中可以检测到LT抗原的表达,有67%细胞表达CD56+分子,核型为异倍体,可在软琼脂上形成细胞集落。结论:用SV40LT转染获得一株可稳定传代且具有CD56+的异倍体恶性淋巴细胞。

SV40-LT基因使牙髓干细胞永生化的研究

目的:分离牙髓干细胞,用含有SV40-LT抗原的慢病毒感染牙髓干细胞以建立永生化细胞株并进行鉴定。方法:消化法获得牙髓干细胞;用慢病毒粒子HBLV-SV40LT-3*flag-PURO感染目的细胞,抗生素筛选出稳定传代的细胞株,并进行干性测定。结果:原代与永生化的牙髓干细胞(iDPSCs)在分化能力及表面标记物的检测无差异;Real-time PCR结果显示,感染组细胞中SV40-LT基因的转录水平显著提高;Western blot结果显示,实验组均可检测到标签蛋白Flag的表达。结论:含有SV40-LT基因片段的慢病毒可使人牙髓干细胞发生永生化,永生化后的细胞仍具有多向分化潜能。

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的 建立人源性肝细胞系 ,为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法 利用SV4 0LTag基因和真核表达载体pcDNA3.1( - )经脂质体转染至来源于 2 5岁男性脑死亡者供肝的原代培养细胞 ,使其永生化 ,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果 经G4 1870 0～30 0 μg/ml筛选 ,4 2d后获一抗G4 18肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长 ,体外培养可无限传代 ,具有分泌白蛋白 (ALB)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶 (AST)及乳酸脱氢酶 (LDH)的功能 ,超微结构观察发现 ,转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征 ,如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经逆转录聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹检测 ,转染肝细胞的ALBmRNA阳性和细胞色素P4 5 0 2E1阳性。

温度调控tsSV40LT抗原转基因干细胞的增殖与分化

脑创伤（TBI）位点及其边缘的半损伤带处于明显的缺血缺氧状态。我们的前期工作证实亚低温治疗可有效改善TBI脑血流、降低脑组织代谢率、减轻局部毒素堆积程度。我们利用温度敏感性猿猴病毒40大T抗原（tsSV40LT）建立一种温度敏感型干细胞株，观察其增殖和分化特征。

正常大肠干细胞的条件永生化

目的 :建立正常人大肠干细胞系。方法 :用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞 ,以含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒感染 ,对其进行永生化 ;然后 ,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定。结果 :用中性蛋白酶分级消化获得的 AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形。该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和 SV4 0大 T抗原的重组逆转录病毒后 8～ 12周出现上皮样细胞克隆 ,经细胞特性鉴定 :PAS染色黏蛋白阳性 ,上皮细胞角蛋白 pan、CK- 8、CK- 19均阳性 ;用 EL ISA- PCR法检测该细胞第 12代和第 4 3代端粒酶活性 ,分别为 0 .4 3、0 .83;用 Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和 SV4 0大 T抗原 ;用 RT- PCR检测示该细胞株表达 Musashi- 1m RNA;以 1× 10 6细胞数接种裸鼠 ,观察 4个月无肿瘤形成 ,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现。结论 :建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征 ,可作为体外研究致癌剂

梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞永生化细胞株的构建及鉴定

分离梅花鹿鹿茸软骨细胞和间充质干细胞,使用SV40 LT抗原慢病毒载体建立永生化软骨细胞和间充质干细胞系并鉴定。将含有SV40 LT基因片段的慢病毒载体,转染人胚肾细胞293T获得包装后的病毒粒子,感染鹿茸软骨细胞及间充质干细胞,连续传代培养,通过形态观察、细胞增殖、real-time PCR、甲苯胺蓝染色法和流式细胞术等方法检测SV40 LT抗原表达以及细胞性质。实验所建立的永生化鹿茸软骨细胞系与间充质干细胞系能够稳定传代并具有较强的体外增值活性。RT-PCR检测到SV40T抗原的表达,通过甲苯胺蓝染色法和流式细胞术鉴定所得细胞系具有原代细胞的基本性质。成功获得永生化的软骨细胞与间充质干细胞系,为后续鹿茸生长及发育研究奠定了基础。

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。

哺乳动物睾丸细胞株的建立及应用

哺乳动物生精过程是一个精细的调节过程 ,人们对于这个过程还了解甚少。这主要是由于维持生殖细胞体外培养的必需条件尚未建立 ,睾丸生精细胞可原代培养的时间太短。因此 ,有必要建立能在体外长期传代的睾丸生精细胞株。Hofmann等人用磷酸钙法将猴病毒 40大T抗原 (sv40lt)基因掺入小鼠睾丸细胞建立了永生的睾丸细胞株 ,并利用这些细胞株研究了睾丸特异基因的表达。随后 ,又通过对小鼠睾丸生精细胞共转染sv40lt基因和编码温度敏感p5 3蛋白基因 ,建立了两个能在体外继续分化的生精细胞株。这些睾丸细胞株的建立为精子发生研究提供了一个有用的实验模型。

GPS2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化及其增殖凋亡的检测

目的利用SV40大T抗原(SV40LT)过表达慢病毒建立永生化的GPS2野生与敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系,并检测GPS2敲除对MEF增殖及凋亡的影响。方法构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,并进行病毒包装。分离胚胎发育9.5 d(E9.5d)的MEF细胞,感染SV40LT慢病毒,连续传代培养50代以上,把仍存活且状态良好的GFP阳性细胞视作永生化成功的MEF细胞。利用高内涵细胞成像分析仪检测永生化MEF细胞的增殖情况,采用AnnexinⅤ/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,获得滴度为4.03×108pfu/ml的病毒。分离E9.5d MEF细胞并感染上述病毒,阳性细胞扩大培养并稳定传代50代以上,成功建立了永生化的MEF细胞系。GPS2敲除MEF细胞的增殖能力明显低于野生型,而二者由于血清撤除所引起的凋亡并无明显差异。结论敲除GPS2抑制MEF细胞的增殖。