SV40TAg真核表达载体的设计与构建

目的设计并构建SV40TAg真核表达载体。方法采用重叠延伸拼接法从pUC19-SV40载体中克隆切除了内含子的SV40LT基因全长,在其5′端连上loxP位点,EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,同时采用重叠延伸拼接法从pEGFP-N1真核表达载体中克隆EGFP基因全长,并在3′端连上loxP位点,两个酶切产物连接后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,DNA序列分析鉴定重组质粒。结果SV40LT基因和两个loxP位点成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中。结论本实验构建的SV40LT重组质粒为利用SV40T抗原进行黑素细胞发育、分化,黑素生成以及黑素瘤发生等研究提供了新的分子工具。

Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag的转基因小鼠肿瘤模型

目的研究Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag小鼠肿瘤模型的肿瘤发生和基因表达情况,探讨c-myc基因的作用。方法用pTRE2-c-myc单阳性转基因小鼠和Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠交配,后代检测得到Tet-onp、TRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠,经强力霉素诱导一段时间以后,观察肿瘤的发生;通过RT-PCR、病理组织切片和磁共振等方法对肿瘤的发生部位和时相进行研究。结果Tet-on、pTRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠①经诱导后发生肿瘤,且发瘤率和发瘤时间高于和短于Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠;②c-myc和SV40Tag基因在表达部位上有所不同。结论c-myc和SV40Tag基因同时表达与SV40Tag基因单独表达时相比,肿瘤发生明显增强,提示c-myc基因与肿瘤的发生有着密切关系。

脑部特异表达SV40Tag转基因动物模型的建立

将猿猴病毒抗原蛋白(SV40Tag)片段克隆进脑部特异表达载体pMM279中,通过显微注射法制作转基因小鼠。采用PCR和Southern blotting检测目的基因整合,并通过RT-PCR检测目的基因的表达。结果表明:共出生29只仔鼠,经PCR检测出3只阳性,Southern blotting检测出2只阳性。RT-PCR检测到SV40Tag仅在前脑部皮层和海马表达。成功获得的脑部特异表达SV40Tag转基因小鼠模型,为SV40Tag的致病机制及脑肿瘤的治疗等研究提供工具。

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

Gene expression analysis of pancreatic cystic neoplasm in SV40Tag transgenic mice model

瞄准：在转基因的老鼠建模的 SV40Tag 在胰腺的膀胱的瘤学习基因表示变化并且关于胰腺的癌症的预防，临床诊断和治疗提供信息。方法：用转基因的鼠标胰腺的膀胱的瘤建模的 pBC-SV40Tag，我们由使用高密度的微数组学习了基因表达式变化。介绍数据的部分基因表示的确认用即时 PCR 被执行。结果：由使用高密度的 oligonucleotide 微数组 14113 基因， 453 在胰腺的膀胱的瘤被增加， 760 减少了包括 oncogenes， cell-cycle- 联系了基因，表明 transduction 相关的基因，骨骼相关的基因和新陈代谢 -- 相关基因。在这些之中，我们证实在 Igf，嘘和 Wnt 的变化与即时 PCR 表明小径。即时 PCR 的结果在基因薄片显示出类似的表示变化。结论：所有改变的表达式基因与房间周期， DNA 损坏和修理被联系，信号小径，和新陈代谢。SV40Tag 可以在支持肿瘤发生与几蛋白质合作。

Deregulation of c-myc and SV40Tag causing brain tumor in mice

Deregulated expressions of both c-myc and simian virus 40 large T antigen (SV40Tag) are consistent features of lots of tumors. To investigate whether the expression of c-myc and SV40Tag in mouse might help develop a model of human tumor, we generated c-myc transgenics by inserting human c-myc gene into pTRE2 of Tet-On system. We obtained conditional expression of SV40Tag transgenics by the Tet-On system from Yangzhou University. Crossing the c-myc transgenic mouse with the SV40Tag transgenic mice to generate bitransgenics we got double-transgenic mice expressing c-myc and SV40Tag by the Tet-On system. After being treated with doxycycline continuously, single-transgenic SV40Tag mice developed brain tumor infrequently (3 of 84, 3.6%) with a long onset (185 d on average). In contrast, double-transgenic c-myc/SV40Tag mice developed brain tumor with a short onset (96 days on average) and a 41% brain tumor incidence rate (7 of 17, 41%). This tumor was assumed to be me- dulloblastoma. Our experiments suggest that deregulated expression of c-myc and SV40Tag in brain might generate a mouse model of human brain tumor that recapitulates some features of human medulloblastoma.

永生化人前软骨干细胞株的构建

背景:前软骨干细胞体外培养增殖能力有限,但永生化细胞株可以提供大量性状稳定的永生化细胞,并且猿肾病毒40大T抗原基因(simian virus40large tumor antigen,SV40Tag)是较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一。目的:以SV40Tag转染的人前软骨干细胞构建永生化人前软骨干细胞株。方法:采用酶消化法及免疫磁珠筛选技术分离纯化人胚胎前软骨干细胞。利用脂质体介导基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代胚胎前软骨干细胞,以未转染细胞作阴性对照。阳性克隆扩大培养,观察细胞形态学以及传代复苏情况,计算细胞存活率和群体倍增时间,绘制细胞生长曲线。以免疫荧光细胞化学技术检测永生化人前软骨干细胞成纤维生长因子受体3,以RT-PCR检测永生化人前软骨干细胞及人前软骨干细胞中SV40Tag和成纤维生长因子受体3表达。结果与结论:贴壁培养的永生化人前软骨干细胞形态与原代人前软骨干细胞形态无明显差别。传代、冻存、复苏对人永生化前软骨干细胞的存活率无影响,第6,10代人前软骨干细胞的存活率降低(P<0.01)。与第6,10代人前软骨干细胞相比,永生化人前软骨干细胞增殖较旺盛,群体倍增时间短、增殖率高(P<0.01)。第2代永生化人前软骨干细胞成纤维生长因子受体3染色阳性,成纤维生长因子受体3的RT-PCR结果显示在约400bp处有一特异形扩增条带,SV40Tag的RT-PCR结果显示在约560bp处有一特异形扩增条带,未转染的原代细胞未见条带。提示以免疫磁珠筛选技术及脂质体转染技术成功构建了SV40Tag永生化人前软骨干细胞株。

猿病毒40大T抗原基因(SV_(40)Tag)肝细胞移植治疗手术介导的急性肝衰竭的实验研究

目的：研究带猿病毒 40大T抗原 (SV4 0 Tag)基因肝细胞移植对手术介导的ALF(Acuteliverfailure)大鼠肝功能及生存率的影响。方法 :雄性Wistar大鼠切除肝脏 90 % ,然后在脾实质内移植普通肝细胞和SV4 0 Tag(Simianvirus 40largeTantigengene)肝细胞 ,观察其肝功能指标及生存率情况。结果 :普通肝细胞移植和SV4 0 Tag细胞移植组肝功能指标及生存率均好于ALF组 ,而SV4 0 Tag肝细胞移植组生存率又高于普通肝细胞移植组。结论 :SV4 0 Tag肝细胞移植及普通肝细胞移植均可改善ALF大鼠的肝功能指标及生存率 ,而SV4 0Tag组长期生存率高于普通肝细胞移植组。

Generation and characterization of a transgenic mouse model for pancreatic cancer

瞄准：产生转基因的肿瘤动物建模的 SV40Tag 并且学习位于肿瘤发生下面的机制。方法：包含 SV40Tag DNA 的乳腺表示向量被产生。Transgene 碎片是进 FVB 老鼠的受精卵的 microinjeted。遗传上操作的胚胎被变成伪 pregnant 女性老鼠的输卵管。PCR 和北污点分析被用于 F1 和 F2 老鼠的遗传型分析。Transgene 表示被 RT-PCR 和免疫组织化学检测。结果：SV40Tag 基因在转基因的老鼠的二根线被检测。他们之一把 transgene 送到 F1，一个肿瘤在这些老鼠的胰被发现。RT-PCR 和免疫组织化学证明那 SV40Tag 基因在肿瘤被表示。转基因的老鼠的病理学的描述证明肿瘤属于胰腺的膀胱的瘤。结论：SV40Tag 转基因的老鼠模型能成功地被建立。转基因的老鼠得一个胰腺的肿瘤，它能被用于肿瘤发生在活体内的分子的机制的调查。

猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建

目的建立猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)永生化大鼠神经前体细胞株,为细胞移植治疗和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用脂质体介导的基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代培养的新生大鼠神经前体细胞,经嘌呤霉素筛选,阳性克隆扩大培养并连续传代。应用巢蛋白抗体进行细胞鉴定,5%胎牛血清诱导细胞分化后,应用免疫细胞化学法检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制细胞生长曲线。用RT-PCR、Southern印迹杂交和免疫细胞化学法检测SV40Tag在转染细胞中的表达。结果转染细胞经筛选培养后获得1 个阳性细胞克隆,免疫细胞化学结果显示细胞的巢蛋白和微管相关蛋白2染色为阳性,增殖能力较强。5%胎牛血清可诱导转染细胞分化为微管相关蛋白2阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。Southern印迹杂交结果显示转染细胞基因组中存在SV40Tag cDNA,并可检测到SV40Tag mRNA及其蛋白的表达。转染细胞经扩大培养,命名为永生化神经前体细胞。贴壁培养的神经前体细胞,群体倍增时间为(22.9±2.7)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论成功地构建了SV40Tag永生化的大鼠神经前体细胞株。