CEACAM6介导上皮间质转化增强胰腺癌细胞侵袭能力和耐药性的研究

目的:研究CEACAM6对胰腺癌细胞株SW1990侵袭能力和耐药性的影响,并探讨上皮间质转化(EMT)在其中的作用。方法:筛选及鉴定过表达CEACAM6的稳定转染SW1990-CEACAM6细胞株,通过定量PCR和Western blot方法检测SW1990细胞株中EMT相关表型标志物的改变。通过Transwell实验检测过表达CEACAM6对SW1990细胞株侵袭的影响,MTT法检测耐药指数(RI)。结果:定量PCR及Western blot验证过表达CEACAM6细胞株SW1990-CEACAM6成功建立,其倾向于向间质细胞转化:波形蛋白(Vimentin)表达明显上调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下降。功能实验证实过表达CEACAM6具有促进SW1990胰腺癌细胞株侵袭作用,同时细胞株耐药性增强。结论:CEACAM6能够促进SW1990胰腺癌细胞株上皮间质转化,从而促进胰腺癌细胞的恶性转化。

重组HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制备及其促癌细胞凋亡活性研究

从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的cDNA,并对其中编码34位Thr的密码子定点突变为Ala的密码子后,经一系列基因操作方法将天然HIV-TAT转导肽的突变体基因HIV-TATm引入Survivin(T34A)基因的5′端,正确构建了表达载体pRSET-B-HIV-TATm-Survivin(T34A),经转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,目的蛋白质以包涵体形式表达,占菌体总蛋白的45%。经3.7L发酵罐分批发酵可收获650mg/L的包涵体,经阳离子交换、凝胶层析分离和柱上复性与透析,得到纯度达96%以上的可溶性目的蛋白HIV-TATm-Survivin(T34A)。目的蛋白对人乳腺癌细胞B-Cap-37、人胰腺癌细胞SW1990和人肝癌细胞SSMC-7721作用4h后有在细胞形态上呈现出显著的凋亡特征,而对人宫颈癌细胞系Hela不敏感,对正常的人内皮细胞系EVC-304未见明显影响。作用24h时MTT法检测显示,120μg/mL目的蛋白对SW1990、B-Cap-37、SSMC-7721和Hela细胞的抑制率分别达到89%、63%、59.5%和39%,且具有剂量依赖性。对最为敏感的SW1990和B-Cap-37以每孔60μg/mL终浓度的目的蛋白作用48h的流式细胞技术检测发现,凋亡率分别为25.6%和19.3%,与对照相比,实验组细胞出现明显的凋亡峰,细胞周期的分布发生明显的变化,65%以上的癌细胞被阻滞于G1期。体外实验结果显示重组目的蛋白具有较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用,预示着良好的抗癌前景。

pEGFP—C1-HSP27真核表达载体的构建及其稳定转染人胰腺癌SW1990细胞株的筛选

目的构建表达热休克蛋白27（HSP27）的携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的真核载体，建立稳定表达HSP72的人胰腺癌SW1990细胞株。方法采用RT—PCR法从SW1990细胞中扩增出带有BamHI、Hind Ⅲ酶切位点的HSP27基因片段，插入真核表达载体pEGFP—C1，鉴定正确后用重组质粒转染SW1990细胞，并筛选稳转细胞株。荧光显微镜观察HSP72的定位，RT—PCR、蛋白质印迹法检测转染细胞HSP27的表达。结果双酶切法鉴定和测序证实重组载体pEGFP—C1一HSP27的DNA序列完全正确，并成功转染SW1990细胞，筛选获得稳转细胞株。荧光显微镜见EGFP主要分布在胞质中，转染细胞的HSP27 mRNA表达明显增加（1．458±0．160比0．897±0．051，P〈0．05），且表达HSP27与EGFP的融合蛋白。结论成功构建真核表达载体pEGFP—C1-HSP27，并筛选获得稳转的细胞株。

HSP27特异性shRNA表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。

Anti-miR-155反义寡核苷酸对胰腺癌SW1990细胞株增殖和凋亡的影响

目的观察anti-miR-155反义寡核苷酸(AMOs)对人胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响。方法将SW1990细胞分为空白组、阴性对照组和AMOs处理组。阴性对照组将阴性对照链转染入SW1990细胞株中,AMOs处理组采用AMOs抑制SW1990细胞内miR-155的活性;CCK-8法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术测定细胞周期及凋亡。结果与空白组及阴性对照组相比,AMOs显著抑制SW1990细胞的增殖(P<0.05),100nmol/L AMOs的抑制率达36.51%,使G0/G1细胞比例显著增加,G2/M期细胞比例显著减少(P<0.05),AMOs处理过的SW1990细胞早期凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 AMOs通过抑制SW1990细胞内高水平表达miR-155的活性,显著抑制SW1990细胞的增殖。

人CXCR4基因对胰腺癌SW1990细胞凋亡和细胞周期的影响

目的:观察人趋化因子受体-4（CXCR4）重组腺病毒对胰腺癌SW1990细胞凋亡和细胞周期的影响。方法:用红色荧光蛋白重组腺病毒AdRFP和过表达CXCR4重组腺病毒AdCXCR4分别感染胰腺癌SW1990细胞做为阴性对照组和实验组,同时建立空白对照组,通过Hoechst33258染色和流式细胞术分别观察细胞凋亡和细胞周期的变化。结果:与空白对照组和阴性对照组相比,Hoechst 33258染色结果显示感染AdCXCR4能明显降低胰腺癌SW1990细胞的凋亡比率;流式细胞术结果显示感染AdCXCR4使SW1990细胞处于G1期的细胞百分比明显减少,S期细胞百分比明显增多（P<0.05）。结论:过表达CXCR4可以抑制胰腺癌SW1990细胞的凋亡,促进其由G1期向S期的转换。

miR-449a对胰腺癌细胞放射敏感性影响

目的 研究miR-449a对胰腺癌SW1990细胞放射敏感性的影响方法 qRT-PCR检测放疗前后胰腺癌SW1990细胞系中miR-449a的表达变化,利用Lipofectamine 2000转染试剂盒将miR-449a mimics及miR-NC转染到SW1990细胞中,流式细胞术、克隆形成实验检测放射处理后细胞放射敏感性变化。使用TargetScan预测及双荧光素酶报告基因实验证明miR-449a与Cyclin D1的靶向作用,免疫组织化学法观察Cyclin D1在胰腺癌组织和胰腺癌旁5 cm的正常胰腺组织的分布,基因敲除Cyclin D1验证其对胰腺癌细胞放射敏感性的影响。结果 经放射处理后,miR-449a在胰腺癌细胞中的表达量明显降低;过表达miR-449a增加了放射后胰腺癌细胞的凋亡率,并使胰腺癌细胞克隆形成率也明显降低;TargetScan预测及双荧光素酶报告基因实验证实了Cyclin D1是miR-449a的靶标;Cyclin D1蛋白在胰腺癌患者组织中的阳性染色率（70%,35/50）明显高于正常胰腺组织（20%,2/10）,Cyclin D1增加了胰腺癌细胞的放射敏感性。结论 miR-449a通过靶向干扰Cyclin D1的表达,促进胰腺癌细胞的放射敏感性。