LTD4及MK571对人结肠癌细胞SW480、Caco-2凋亡和增殖作用的体外研究

目的 观察半胱氨酰白三烯D4（LTD4）及半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂MK571对人结肠癌细胞株SW480、Caco-2增殖和凋亡的影响.方法 MTT法检测细胞生长活性;FITC Annexin V/碘化丙啶（PI）双染流式细胞术检测细胞的凋亡率;PI染色细胞,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 12.5 ～ 400 μg/L的LTD4对结肠癌SW480细胞有促增殖作用,且存在时效和量效依赖性;而1.6～12.5μg/L的LTD4处理24、48 h,对SW480细胞的增殖抑制作用无明显影响,作用时间延长至72 h,可促进SW480细胞的增殖.50～ 400 μg/L的LTD4对结肠癌Caco-2细胞有促增殖作用,且存在时效和量效依赖性;而1.6-50 μg/L的LTD4对结肠癌Caco-2细胞的影响与对照组相比差异无统计学意义.6.25～200 μmol/L的MK571对结肠癌SW480细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而0.8 ～ 6.25 μmol/L的MK571对SW480细胞的影响与对照组相比无明显差异.25～ 200 μmol/L的MK571对结肠癌Caco-2细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而0.8～ 25 μmol/L的MK571对结肠癌Caco-2细胞的影响与对照组相比差异无统计学意义.与阴性对照组相比,25 ～ 100 μg/L的LTD4对2种结肠癌SW480细胞和Caco-2细胞有促凋亡作用,且存在时效和量效依赖性;而100、200 μmol/L的MK571对2种结肠癌的凋亡无明显作用.与阴性对照组相比,25 ～ 100 μg/L的LTD4可以降低2种结肠癌细胞株G0/G1期比例,增加G2/M及S期比例;而100、200 μmol/L的MK571增加2种结肠癌细胞G0/G1期的比例,降低G2/M及S期比例.结论 LTD4具有促进人结肠癌SW480、Caco-2细胞株增殖的作用,该作用可能的作用机制是抑制凋亡、增加G2/M及S期细胞比例.MK571可抑制2种结肠癌细胞株的增殖,但对凋亡无明显影响,其抑制增殖作用的可能机制是阻滞细胞于G0/G1期.

MK886对人结肠癌细胞SW480、Caco-2增殖和凋亡的影响

目的:观察5-脂氧合酶活化蛋白(5-lipoxygenase activating protein,FLAP)抑制剂MK886对人结肠癌细胞株SW480、Caco-2增殖和凋亡的影响.方法:噻唑蓝(MTT)比色法检测6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L MK886作用24、48、72 h对S W480和C a c o-2细胞的抑制率;A n n e x i n V-F I T C/P I双染流式细胞术检测12.5、25、50、100μmol/L MK886作用72 h的结肠癌细胞凋亡率;流式细胞仪检测12.5、25、50μmol/L MK886作用72 h的结肠癌细胞周期.结果:50μmol/L到200μmol/L的MK886对结肠癌SW480细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而12.5μmol/L到25μmol/L浓度的MK886处理24 h后,对SW480细胞无明显作用,延长时间至48、72 h后,作用有统计学意义,且同样存在时效和量效依赖性;6.25μmol/L的MK886对SW480细胞无抑制作用.25μmol/L到200μmol/L的MK886对结肠癌Caco-2细胞有抑制作用,且存在时效和量效依赖性;而6.25μmol/L到12.5μmol/L浓度的MK886对Caco-2细胞无抑制作用.200μmol/L MK886作用24h即可明显抑制SW480、Caco-2两种结肠癌细胞株的增殖,抑制率接近90%.12.5μmol/L到100μmol/L浓度的MK886对两种结肠癌SW480和Caco-2细胞有凋亡作用,且存在时效和量效依赖性;12.5μmol/L到50μmol/L浓度的MK886可以增加两种结肠癌SW480和Caco-2细胞G0/G1期比例,降低S期比例.结论:MK886具有显著的抑制人结肠癌SW48-0、Caco-2细胞株增殖的作用,该作用可能是通过阻滞细胞于G0/G1期,并诱导肿瘤细胞凋亡所致.

苦参碱抑制人大肠癌SW480细胞环氧化酶-2的表达

目的探讨苦参碱(MT)对人大肠癌SW480细胞环氧化酶(COX-2)表达的影响。方法采用MTT法检测MT对SW480细胞的增殖抑制作用,采用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting等方法检测不同浓度(0.25～2.0mg/mL)苦参碱对细胞COX-2表达的影响。结果MT抑制SW480细胞增殖呈剂量和时间依赖性,其48hIC50=0.516mg/mL。倒置显微镜下以及细胞爬片HE染色可见实验组细胞出现典型的细胞凋亡形态改变:细胞皱缩,体积减小,胞浆凝聚,空泡化明显,形成"印戒"细胞。苦参碱可抑制SW480细胞的COX-2 mRNA、蛋白表达水平。结论MT在体外能抑制SW480细胞的增殖,其抑制作用具有明显的量效和时效关系。苦参碱具有抑制SW480细胞的COX-2基因转录、蛋白表达和功能活性等作用,在时间范围(8～72h)内,表现出时效关系。

青藤碱对BALB/c-nu/nu裸小鼠高侵袭性人结肠癌SW 480移植瘤增殖及环氧合酶-2表达的影响

目的观察青藤碱对高侵袭性人结肠癌细胞株SW 480移植瘤细胞周期及结肠瘤体组织中环氧合酶-2(COX-2)表达的影响,研究青藤碱防治结肠癌的机制。方法先用5只免疫功能正常的BALB/c-nu/nu裸小鼠建立高侵袭性人结肠癌瘤源,3周后取直径约2 mm的瘤块移植于20只免疫缺陷的BALB/c-nu/nu2裸小鼠回盲浆膜凹龛部,1周后再随机分为结肠癌组和青藤碱组。青藤碱组按10 m L/(kg·d)灌10%青藤碱治疗30 d,结肠癌组灌0.9%氯化钠注射液对照。测量BALB/c-nu/nu裸小鼠结肠瘤体积、瘤质量并计算肿瘤抑制率;流式细胞仪检测结肠瘤体组织SW 480细胞在G1、G2、M和S期的细胞周期比例;免疫组化法检测结肠瘤体组织COX-2的表达,RT-PCR法检测COX-2 m RNA表达。结果与结肠癌组比较,青藤碱组结肠瘤体积、瘤质量及S期细胞比值明显降低、G1、G2期细胞比值提高,肿瘤抑制率为(39.75%)(P<0.05);COX-2和COX-2 m RNA低表达(P<0.05)。结论青藤碱可能在G1、G2和S期诱导SW 480细胞阻滞、抑制结肠癌细胞株SW 480细胞的有丝分裂,并通过下调COX-2表达而间接影响癌细胞的增殖,具有抗高侵袭性人结肠癌的作用。

姜黄素调控结肠癌SW480细胞skp2-p27kip通路的研究

目的:探讨姜黄素抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡的分子机制。方法:通过MTT检测不同浓度姜黄素(0,7.5,15,30,60μmol/L)处理结肠癌细胞SW480后凋亡情况;通过蛋白免疫印迹方法检测不同浓度姜黄素(0,7.5,15,30,60μmol/L)处理结肠癌细胞后细胞中skp2、p27kip蛋白表达情况。结果:姜黄素能抑制结肠癌细胞SW480增殖并促进其凋亡,有浓度和时间依赖;姜黄素降低了结肠癌细胞SW480中skp2蛋白的表达(P<0.05),而促进了p27kip蛋白的表达,有时间和剂量依赖,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:姜黄素能抑制结肠癌细胞SW480的增殖并促进其凋亡,有时间和剂量依赖,这种抗癌效应可能与干扰skp2-p27kip通路有关。

EGCG对LoVo和SW480结肠癌细胞株的作用及对Notch1与Notch2基因表达的影响

目的:探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对结肠癌细胞株LoVo细胞和SW480细胞增殖的抑制作用,研究其对Notch1与Notch2的基因表达的影响.方法:体外培养LoVo细胞和SW480细胞,采用不同浓度的EGCG(10、20、35mg/L)对其进行干预,MTT法检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞细胞凋亡和细胞周期的影响.实时荧光定量PCR检测EGCG干预后的LoVo细胞和SW480细胞的Notch1与Notch2基因的表达情况.结果:MTT法检测EGCG对LoVo细胞和SW480细胞增殖均具有抑制作用,且呈浓度依赖性,不具有时间依赖性.流式细胞仪检测EGCG能增强LoVo细胞和SW480细胞的凋亡率,且剂量与凋亡率呈正相关.EGCG能将SW480细胞和LoVo细胞周期阻滞在G0/G1期,阻碍其向S期转换,抑制其细胞增殖.实时荧光定量PCR检测EGCG能下调两株细胞Notch2的基因表达,而SW480细胞的Notch1基因表达有下调的趋势,LoVo细胞的Notch1基因表达有上调的趋势,但差异均无显著意义.结论:EGCG对体外培养的LoVo细胞和SW480细胞的增殖有明显抑制作用,且能诱导细胞凋亡和影响细胞周期,其作用机制可能与下调Notch2的基因表达及激活Notch信号转导途径有关,但是EGCG对Notch1基因表达的影响尚需要做进一步探讨.

藏药湿生扁蕾对人结肠癌SW480细胞凋亡调控因子Bcl-2及Bax的mRNA表达的影响

目的:探讨藏药湿生扁蕾对SW480细胞凋亡调控因子Bcl-2mRNA及BaxmRNA表达的影响。方法:SW480细胞接种于6孔培养板中,24 h后分别以不同浓度(250、500、1000μg/ml)的湿生扁蕾干预,继续培养24h后,提取每组总RNA,以GAPDH和β-actin基因为内参,采用RT-PCR法检测Bcl-2及Bax的mRNA表达水平。结果:Bcl-2 mRNA表达随湿生扁蕾浓度增加而减少,而Bax mRNA表达随湿生扁蕾浓度增加而增加,并呈现明显的剂量依赖关系。结论:藏药湿生扁蕾干预SW480细胞凋亡与其抑制Bcl-2的表达和促进Bax的表达有关。

Peroxiredoxin 2基因慢病毒载体的构建及对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

目的:构建Peroxiredoxin 2(Prdx2)基因慢病毒表达载体,建立能够稳定高表达Prdx2的结直肠癌SW480细胞株,研究Prdx2的高表达对SW480细胞生长增殖的影响。方法:利用PCR扩增Prdx2编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin(GV218)中,构建Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒,鉴定后将其转染SW480细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot方法检测SW480细胞中Prdx2的mRNA和蛋白水平表达情况;MTT法检测细胞生长情况;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果:构建的重组慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)经鉴定正确;慢病毒转染SW480细胞后,细胞中Prdx2在mRNA和蛋白水平高表达。MTT法及平板克隆形成实验结果显示Prdx2高表达的SW480细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。结论:成功构建Prdx2基因慢病毒表达载体Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin,筛选出稳定高表达Prdx2的SW480细胞株;高表达的Prdx2分子可显著促进结直肠癌SW480细胞增殖。

灵芪胶囊对直结肠癌SW480细胞bcl-2表达的研究

目的:针对直结肠癌相关基因bcl-2,观察灵芪胶囊抑制肿瘤作用机理。方法:SW480细胞体外培养,应用real-time PCR检测bcl-2 RNA的含量。结果:灵芪胶囊抑制bcl-2 mRNA表达。结论:灵芪胶囊具有抑制人源性直结肠癌SW480细胞作用,其作用机制可能与bcl-2有关。

siRNA沉默RAD18抑制结肠癌SW480细胞FANCD2蛋白泛素化并增强其对丝裂霉素C的敏感性

目的:研究RAD18特异性siRNA对结肠癌SW480细胞FANCD2泛素化和对化疗药物丝裂霉素C敏感性的影响。方法 :RAD18特异性siRNA转染SW480细胞后用丝裂霉素C处理,通过Western blot检测细胞RAD18及FANCD2泛素化的表达,MTT法检测干扰RAD18后细胞对丝裂霉素C的敏感性。结果:RAD18特异性siRNA转染SW480细胞96 h后,RAD18基因的表达明显降低,导致经丝裂霉素C处理后FANCD2泛素化表达明显降低;siRAD18组细胞对丝裂霉素C的敏感性显著增强。结论 :抑制RAD18蛋白表达能延缓结肠癌细胞FANCD2泛素化表达,并增强SW480细胞对丝裂霉素C的敏感性。

消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响

目的观察消痰通腑方对结肠癌SW480细胞增殖、迁移的影响,探讨其分子作用机制。方法采用不同浓度消痰通腑方作用结肠癌SW480细胞,CCK8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖,Transwell小室实验检测细胞迁移能力,RT-q PCR检测磷脂酶A2(PLA2)和环氧合酶2(COX-2)m RNA表达,Western blot检测PLA2和COX2蛋白表达,RNA干扰技术沉默SW480细胞株中PLA2基因表达。结果消痰通腑方低、高剂量组较对照组结肠癌SW480细胞增殖能力明显减弱(P<0.05),克隆形成率及迁移能力明显下降(P<0.05,P<0.01),PLA2、COX-2 m RNA和蛋白表达均明显下调(P<0.05),并呈浓度依赖性;与质粒对照组和对照组比较,PLA2 sh RNA干扰组细胞PLA2和COX2蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论消痰通腑方可抑制结肠癌SW480细胞增殖和迁移,其机制可能与PLA2及COX-2的表达下调有关。

miR-126对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡、周期及SOX2表达的影响

目的探讨miR-126通过靶向调控SOX2表达影响结肠癌细胞的增殖和凋亡。方法脂质体Lipofectamine^(TM)2000将miR-126 mimics和miR-126 NC转入SW480细胞中,RT-PCR法检测miR-126表达,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,RT-PCR法及western blot检测细胞中SOX2蛋白及mRNA表达,并进行荧光素酶报告基因分析。结果与miR-126 NC组比较,miR-126 mimics组miR-126表达量显著提高(P<0.01),细胞活力降低(P<0.01),细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高(P<0.01),细胞周期阻滞于G1期(P<0.01),同时miR-126 mimics能够靶向下调SOX2蛋白及mRNA表达(P<0.01)。结论 miR-126 mimics通过靶向下调SOX2表达进而抑制SW480细胞增殖,并诱导细胞凋亡。

低氧培养的SW480细胞中NDRG1和MMP-2的表达

目的观察低氧对结肠癌SW480细胞中NDRG1、MMP-2蛋白表达的影响。方法分别在常规(常氧组)和低氧(低氧组)条件下培养结肠腺癌SW480细胞。运用免疫细胞化学染色法检测2组NDRG1蛋白表达,并用图像分析仪测光密度值(OD值);ELISA法检测MMP-2表达。结果低氧组细胞NDRG1呈强阳性表达,而常氧组表达较弱,低氧组细胞NDRG1蛋白表达水平(0．1634-4-0．0079)显著高于常氧组(0．1358±0．0027)(P<0．05);MMP-2表达也显著高于常氧组(P<0．01)。结论低氧诱导了SW480细胞NDRG1、MMP-2表达上调。

miR-126-5p靶向Notch2对结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

目的:探讨miR-126-5p对结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其作用机制。方法:用miR-126 mimic和pcDNA Notch2(pc-Notch2)等分别或同时转染结肠癌SW480细胞,用qPCR法检测miR-126-5p和Notch2的表达;荧光素酶报告实验观察miR-126-5p和Notch2的靶向关系;CCK-8法、划痕愈合实验、Transwell小室法和Annexin V/PI染色流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,Western blotting检测Notch2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9的表达。结果:转染miR-126 mimic能显著升高SW480细胞miR-126-5p的表达水平(P<0.01)和显著抑制SW480细胞Notch2的表达(P<0.01),同时证实Notch2上存在miR-126-5p的结合位点。上调miR-126-5p显著抑制SW480细胞增殖并降低PCNA的表达水平(P<0.01)、升高细胞凋亡率和cleaved Caspase-9的表达水平(均P<0.01),pc-Notch2显著减弱miR-126 mimic对SW480细胞增殖和凋亡的调控作用;miR-126 mimic显著降低SW480细胞划痕愈合率和穿膜细胞数(均P<0.01)、抑制MMP-2和MMP-9的表达(P<0.01);pc-Notch2显著减弱miR-126 mimic对SW480细胞迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9表达的抑制作用(均P<0.01)。结论:miR-126-5p通过抑制Notch2表达,降低结肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭能力。

Prdx2基因表达情况对结直肠癌SW480细胞影响作用分析

目的探讨硫氧还蛋白过氧化物酶2(Prdx2)基因表达对结直肠癌SW480细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法采用慢病毒空载体(空白组)、干扰片段(Prdx2-shRNA)慢病毒载体转染结直肠癌SW480细胞(实验组),野生型结直肠癌SW480细胞作为对照组,分别于转染后培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h采用MTT法检测SW480细胞增殖情况,采用流式细胞仪技术检测培养120 h后细胞的凋亡率,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRt-PCR)及Westernblot法检测Prdx2、Survivin mRNA及蛋白的表达,采用Transwell侵袭实验检测SW480细胞的侵袭能力。结果实验组的W480细胞凋亡率显著高于空白组和对照组(P<0.05),培养48 h、72 h、96 h、120 h,实验组的W480细胞增殖能力明显低于空白组和对照组(P<0.05),实验组的SPrdx2、Survivin mRNA及蛋白相对表达水平显著低于空白组和对照组(P<0.05);Transwell侵袭实验结果显示,实验组的转染结直肠癌SW480细胞侵袭能力强于空白组和对照组(P<0.05)。结论 Prdx2基因沉默会抑制结直肠癌SW480细胞的增殖、促进凋亡,但是会增强结直肠癌SW480细胞的侵袭能力。

PMS2通过ERK/ERCC1通路对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响

目的:探讨减数分裂后分离蛋白2(PMS2)表达对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响,阐明PMS2与切除修复交叉互补组1(ERCC1)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号转导通路的关系。方法:将PMS2 siRNA质粒和PMS2过表达质粒分别转染入结肠癌SW480细胞(分别为PMS2敲减组和PMS2过表达组),同时设PMS2敲减对照组(siRNA-NC组)和PMS2过表达对照组(PMS2 control组)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中PMS2 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中PMS2蛋白表达水平,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,细胞划痕实验检测各组细胞迁移率,Transwell小室实验检测各组细胞中侵袭细胞数,流式细胞术检测顺铂作用后各组细胞凋亡率。通过String数据库,对PMS2、ERCC1和ERK上下游蛋白的关系进行生物信息学分析。SW480细胞分别采用3条siRNA进行PMS2和ERCC1敲减,采用RT-qPCR法验证PMS2与ERCC1的相互作用,采用Western blotting法检测各组细胞中PMS2、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达水平。结果:RT-qPCR法和Western blotting法检测,PMS2基因敲减和过表达细胞模型构建成功。与siRNA-NC组比较,PMS2敲减组细胞增殖活性和细胞迁移率明显升高(P<0.05或P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),顺铂作用后细胞凋亡率明显降低(P<0.01);与PMS2 control组比较,PMS2过表达组细胞增殖活性和细胞迁移率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),顺铂作用后细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。蛋白-蛋白互作(PPI)富集P值为2.09e-07,包含ERCC1和ERK1/2等相互作用节点数共有13个,提示PMS2、ERCC1和ERK1/2之间可能存在调控作用。与siRNA-NC组比较,各PMS2敲减组细胞中ERCC1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01);与siERCC1-NC组比较,各ERCC1敲减组细胞中PMS2 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与siRNA-NC组比较,PMS2敲减组细胞中PMS2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01);与PMS2 control组比较,PMS2过表达组细胞中PMS2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。结论:PMS2表达可影响结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力。PMS2与ERCC1存在互相作用关系,并可通过调节ERCC1参与ERK信号转导通路。

METTL3修饰的RNASEH1-AS1通过BUD13/ANXA2/Wnt/β-catenin轴调控结直肠癌SW480细胞的恶性生物学行为

目的:探究甲基转移酶样蛋白3(METTL3)修饰的RNASEH1-AS1通过BUD13/膜联蛋白A2/Wnt/β-连环蛋白(BUD13/ANXA2/Wnt/β-catenin)轴调控结直肠癌细胞SW480恶性生物学行为的分子机制。方法:选取2022年6月至2022年11月间在复旦大学附属中山医院厦门医院手术治疗的24例CRC患者,收集患者的CRC组织和对应的癌旁组织,用qPCR法检测其中METTL3、RNASEH1-AS1、BUD13、ANXA2、β-catenin、GSK-3β mRNA的表达,用Pearson法分析CRC组织中RNASEH1-AS1表达分别与METTL3和BUD13表达的相关性。常规培养结直肠癌细胞SW480,分为sh-NC组、sh-RNASEH1-AS1组、NC组、sh-METTL组、si-NC组、si-BUD13组、sh-RNASEH1-AS1+pc-NC组、sh-RNASEH1-AS1+pc-ANXA2组、sh-METTL+pc-NC组、sh-METTL+pc-ASEH1-AS1组,用Lipofectamine?2000转染试剂将sh-NC、sh-RNASEH1-AS1、sh-NC、sh-METTL、si-NC、si-BUD13、sh-RNASEH1-AS1+pc-NC、sh-RNASEH1-AS1+pc-ANXA2、sh-METTL+pc-NC、sh-METTL+pc-ASEH1-AS1分别转染SW480细胞,用qPCR法检测后SW480细胞中METTL3、RNASEH1-AS1、BUD13、ANXA2的表达,细胞克隆形成实验检测转染后各组SW480细胞的增殖能力,FCM术检测转染后各组SW480细胞的凋亡情况,细胞划痕实验检测转染后各组SW480细胞的迁移能力,WB法检测转染后各组SW480细胞中ANXA2、β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、c-Myc、cyclinD1蛋白表达,RNA免疫沉淀(RIP)法检测RNASEH1-AS1与BUD1、BUD1与ANXA2的靶向关系。结果:数据库CRC数据分析和中国人CRC组织和癌旁组织的qPCR法检测结果均显示,与癌旁组织相比CRC组织中METTL3、RNASEH1-AS1、BUD13、ANXA2、β-catenin、GSK-3β均呈明显高表达(均P<0.01),且RNASEH1-AS1表达与METTL3(r=0.698,P<0.01)、BUD13(r=0.784,P<0.01)的表达呈正相关。在结直肠癌各细胞中METTL3、RNASEH1-AS1、BUD13、ANXA2 mRNA均呈高表达(均P<0.05);敲减RNASEH1-AS1或METTL3后SW480细胞中RNASEH1-AS1、BUD13、ANXA2表达显著降低(均P<0.05),而过表达RNASEH1-AS1后上述分子表达明显上调(均P<0.05);敲减RNASEH1-AS1或METTL3可抑制SW480的增殖、迁移和p-β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、cyclinD1蛋白的表达,促进其凋亡(均P<0.05),而过表达RNASEH1-AS1则可促进SW480增殖、迁移和p-β-catenin、p-GSK-3β、c-Myc、cyclinD1蛋白的表达和抑制其凋亡(均P<0.05);RNASEH1-AS1通过招募BUD13靶向促进ANXA2的表达(均P<0.05);过表达ANXA2可部分逆转敲减RNASEH1-AS1对SW480细胞的影响(均P<0.05)。结论:METTL3修饰的RNASEH1-AS1通过BUD13/ANXA2/Wnt/β-catenin轴调控SW480细胞的恶性生物学行为。

二烯丙基二硫对人结肠癌SW480细胞周期的阻滞作用

背景与目的:前期研究表明,二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)能有效在体内外抑制人结肠癌细胞增殖,并将细胞阻滞于G2/M期。本实验旨在进一步探讨DADS对人结肠癌SW480细胞周期阻滞作用的可能机制。方法:采用MTT、细胞计数法检测DADS对SW480细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测DADS对SW480细胞周期的影响;免疫细胞化学法检测DADS作用后PCNA、P53表达情况,蛋白印迹法分析P21WAF1、细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)表达的改变。结果:不同浓度DADS作用SW480细胞24、48、72h后,对细胞增殖的抑制作用及细胞群体倍增时间呈浓度、时间依赖性增加。流式细胞仪分析结果显示,DADS作用SW480细胞后,G0/G1期细胞含量降低,S期细胞比例变化不大,而G2/M期细胞比例则明显增加,且随着处理浓度的增加和处理时间的延长,其G2/M期细胞含量逐渐增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DADS作用后,免疫细胞化学检测显示,PCNA、P53蛋白表达明显下降。蛋白印迹分析显示,DADS作用SW480细胞后,Cyclin B1蛋白表达明显下降,P21WAF1蛋白的表达明显升高,均呈时间效应关系。结论:DADS可能通过下调PCNA、P53、Cyclin B1蛋白表达,上调P21WAF1蛋白表达引起SW480细胞G2/M期阻滞。

苦豆子总碱对SW480细胞株及裸鼠移植瘤的影响

目的:探讨苦豆子总碱(TASA)对SW480细胞株及裸鼠移植瘤的抑制作用及机制。方法:利用MTT法检测不同浓度TASA对SW480细胞的增殖抑制影响;Annexin V-FITC标记法检测SW480细胞凋亡;建立裸鼠移植性实体瘤SW480模型,观察TASA作用下移植性实体瘤的体积和质量,用荧光定量PCR法检测移植性实体瘤组织中Caspase-3、Caspase-9及BCL-2 mRNA的表达。结果:实验结果显示TASA对体外培养的SW480细胞增殖具有明显抑制作用,并可诱导其发生凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性,48 h IC50=0.92 mg/mL;TASA高、低剂量组裸鼠移植性实体瘤SW480的体积和质量、BCL-2表达低于模型组,Caspase-3、Caspase-9表达则显著高于模型组,其抑瘤率分别达到57.3%、37.4%。结论:TASA对SW480细胞株及裸鼠移植瘤均有抑制作用,其机制可能与诱导凋亡有关。

藤黄酸对人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响

目的探讨藤黄酸对人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用及藤黄酸对血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)表达的影响,初步探讨藤黄酸抗结直肠癌的作用机制。方法建立人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型,15 d后开始用不同浓度藤黄酸治疗,28 d后处死,测定裸鼠移植瘤的体积和质量,计算其抑瘤率;HE染色观察肿瘤坏死、微血管形态的变化;提取组织中总RNA和蛋白,RT-PCR检测肿瘤组织中VEGFR2 mRNA水平,免疫组织化学法检测肿瘤组织中VEGFR2蛋白表达水平和肿瘤微血管密度(MVD)。结果 (1)对照组,藤黄酸低、中、高剂量组移植瘤体积分别为(691±67.2)、(481±62.9)、(377±37.0)、(190±67.9)mm3,瘤质量分别为(0.681±0.072)、(0.473±0.062)、(0.377±0.044)、(0.192±0.068)g,藤黄酸低、中、高剂量组瘤体积、瘤质量均低于对照组(均P<0.05);藤黄酸低、中、高剂量组抑瘤率分别为31%、45%、72%;(2)HE染色可见藤黄酸组肿瘤组织出现凝固性坏死,肿瘤新生血管闭锁;(3)与对照组相比,藤黄酸组VEGFR2 mRNA表达丰度和蛋白水平明显降低,并呈显著量效关系;(4)对照组MVD明显高于藤黄酸组(P<0.05)。结论藤黄酸能够抑制人结肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤的生长,能抑制结肠癌移植瘤内新生血管内皮细胞的生长,其机制可能与抑制VEGFR2的表达有关。