1994年～2004年杭州地区O139群霍乱弧菌携SXT元件和整合子的特征

目的了解杭州地区O139群霍乱弧菌菌株携带SXT元件和整合子的特征。方法对1994年～2004年杭州地区腹泻患者分离的ctxA阳性霍乱弧菌O139群菌株25株（1994年～2004年）、O1群菌株（1997年～2001年）18株，应用PCR进行SXT元件和Ⅰ类整合子检测，并对Ⅰ类整合子携带的基因盒进行核酸序列测定，同时检测菌株对10种抗生素的耐药谱。结果1994年分离的浙江省首株O139群菌株即开始携带SXT元件。1994年～2004年分离的25株O139群菌株中，SXT元件携带率为96．00％（24／25）；18株O1群菌株（1997年～2001年）均属O139群出现后分离的，SXT元件为83．33％（15／18）。Ⅰ类整合子最早出现于1998年分离的O139群菌株，总阳性率为60．00％（15／25）；在2000年以后检出的O139群菌株中，携带率为81．25％（13／16）；Ⅰ类整合子中的基因盒阵列有两种：一为aadA2，占93．33％（14／15）；另一为dfrAI2＋orfF＋aadA3c，占6．67％（1／15）。18株O1群菌株（1997年～2001年）中未发现有Ⅰ类整合子。结论SXT元件在O139群（1994年～2004年）和O1群（1997年～2001年）霍乱弧菌中有较高的携带率。Ⅰ类整合子在2000年以后检出的O139群菌株中有较高的携带率。携带的基因盒提示，O139群菌株与其他细菌可能通过Ⅰ类整合子途经交换对抗生素耐药基因。

携带SXT/R391家族整合接合元件多重耐药菌株的高效筛选与分析

本研究建立了一种抗生素平板与分子检测相结合的高效筛选水产品中携带SXT/R391家族整合接合元件(integrative and conjugative elements,ICEs)的多重耐药菌株的方法。采用美国临床与实验室标准研究所标准Kirby-Bauer纸片扩散法、需氧菌液体微量稀释法,以及接合实验,对筛选、鉴定获得的携带SXT/R391家族ICEs的变形杆菌(Proteus vulgaris)进行了抗菌素、重金属抗性以及ICEs元件接合转移活性的分析。结果表明:运用本研究建立的筛选法可有效获得含有多重耐药基因的ICEs元件,其检出率为3%,远高于常规聚合酶链式反应技术的检测水平(<1‰)。受试菌株对六大类10种抗菌素均表现出抗性,并且对重金属镉、铜、锌和汞具有高度耐受性。接合实验证明了受试菌株所携带的ICEs元件在普通变形杆菌与大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655之间的自我转移活性。

SXT/R391元件核心基因的生物信息学分析

目的:SXT/R391元件是革兰阴性菌中研究最充分、已知成员最多的整合性接合元件家族,本研究的主要目的是探讨SXT/R391元件核心基因组的适应性进化规律。方法:收集数据库中及文献报道的SXT/R391家族元件数据,并利用已测序的细菌基因组序列预测该家族元件,分析元件核心基因的进化特性。结果:通过文献搜集和预测,共获得83个SXT/R391元件的基因组序列。在52个核心基因中,计算发现22个基因在进化过程中经历了重组,基因分布于SXT/R391元件的4个必需模块。此外,在7个基因中检测到了正选择信号。结论:分析了SXT/R391元件核心基因的进化机制,为了解该家族的进化和扩散奠定了基础。

一起O139群霍乱弧菌引起的食物中毒菌株的耐药性分析

目的:探讨多重耐药O139群霍乱弧菌形成的可能分子机制。方法:对杭州一起暴发的65株O139群霍乱菌株进行药敏试验,取其中20株多重耐药菌株进行结合性转座子样SXT元件标志基因intSXT和Ⅰ类整合子的PCR检测,并对Ⅰ类整合子基因盒区扩增产物应用限制性酶切和DNA测序分析携带的基因盒。结果:65株O139群霍乱菌株中,56株(86.2%)均呈同一耐药谱,对11种抗生素多重耐药,仅对诺氟沙星、环丙沙星及丁胺卡那敏感。20株多重耐药菌株中,SXT元件标志基因intSXT均阳性,Ⅰ类整合子5′保守区、基因盒区和3′保守区也均阳性。其携带基因盒为氨基糖苷腺苷酰基转移酶基因aadA2。结论:此次暴发的多重耐药的O139群菌株均携带有SXT元件,Ⅰ类整合子在多重耐药菌株的形成中起了一定的作用。

细菌整合性接合元件SXT／R391研究进展

SXT/R391家族是整合性接合元件中多样性最为丰富、成员最多的一个家族。SXT/R391包括保守的核基因以及可变区基因,SXT/R391保守的核心基因主要涉及SXT/R391的整合/剪切、自我接合转移、元件表达的调节。SXT/R391可变区基因的编码产物主要负责宿主对抗生素的耐药性、重金属离子抗性、生物膜形成和细菌运动能力的调节,编码毒素-抗毒素系统以阻止SXT/R391从宿主丢失。一些SXT/R391也编码限制性修饰系统、解旋酶、核酸内切酶。SXT/R391受SetCD正性调控,受SetR负性调控。SXT/R391接合转移过程不会导致其在原供体菌基因组丢失。SXT/R391可以阻止细胞获得其它密切相关的同类SXT/R391但不排斥异质性ICE获得,在SXT/R391自身编码的重组系统作用下获得的异质性ICE导致杂合ICE的产生。SXT/R391具有相当高的转移频率和宽广宿主范围,目前已经有超过40个不同类型的SXT/R391在不同种属的细菌中被发现,以弧菌为最多。已知的SXT/R391集中出现在非洲和亚洲沿海地区,且来源多为海洋细菌,表明海洋环境很可能是SXT/R391主要的贮藏库,并且经由海洋环境株向临床株扩散。日益增加的选择压力很可能加速了SXT/R391的传播。鉴于SXT/R391的转移和盛行带来的风险,卫生部门以及医学微生物科学家应对其扩散保持充分警惕。

抗生素对溶藻弧菌SXT/R391元件转移频率的影响

【目的】研究萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素3种抗生素对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)SXT/R391元件ICEVal A056-1转移频率的影响。【方法】利用PCR检测溶藻弧菌A056中ICEVal A056-1的自我剪切、转移潜力。通过溶藻弧菌A056与大肠杆菌菌株VB111的接合实验,研究溶藻弧菌分别在含不同浓度萘啶酸、诺氟沙星、卡那霉素的LB培养基中培养15 min或30 min后,ICEVal A056-1转移频率的变化规律。【结果】溶藻弧菌A056细胞中有环状形式的ICEVal A056-1分子存在,具有水平转移潜力;溶藻弧菌A056在含40μg/m L萘啶酸的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的19.59倍;在含50μg/m L诺氟沙星的LB中培养15 min后,ICEVal A056-1转移频率是对照组的31.25倍;在含不同浓度卡那霉素的LB中培养30 min后,ICEVal A056-1转移频率与对照组没有显著差别。【结论】部分抗生素的使用可以明显促进溶藻弧菌ICEVal A056-1向大肠杆菌的转移,因此海洋环境中抗生素的滥用及随意排放很可能加剧ICEs(integrating conjugative elements)从溶藻弧菌到其他细菌的传播。

基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测霍乱弧菌中SXT元件

目的利用重组酶聚合酶扩增技术与测流层析相结合方法建立霍乱弧菌中SXT元件的快速检测方法。方法基于SXT元件的保守区设计重组酶聚合酶扩增方法的引物及探针,评价该方法的特异度及灵敏度。结果该方法可检测核酸浓度最低为20拷贝/μl,与实时荧光定量PCR方法的检测下限相近,且特异性较好。结论该检测方法操作简单,特异性良好,敏感度高且无需大型精密实验设备,适合现场使用。

副溶血弧菌TF2中整合接合元件ICEVpaTF2的生物信息学特征和剪切、环化活性

【目的】从副溶血弧菌TF2基因组框架序列中拼接获得整合性接合元件(ICE)ICEVpaTF2的全序列,分析其基因组学特征;研究ICEVpaTF2是否具有从基因组中剪切、环化活性以及剪切、环化时attB和attP位点如何形成。【方法】对副溶血弧菌TF2基因组框架序列进行RAST注释,发现其基因组中可能存在一个完整的ICE元件,命名为ICEVpaTF2,经过人工拼接和PCR扩增测序验证,得到完整的ICEVpaTF2序列,并对ICEVpaTF2再次进行RAST注释和ICE元件部分特征分析。通过PCR检测,探索ICEVpaTF2是否能够从基因组剪切并环化。通过attL、attR、attB、attP位点序列比较,探索attB和attP重组特征。【结果】ICEVpaTF2全长83588 bp,包含SXT/R391家族ICE元件的52个保守核心基因,它们与ICE切除、整合、自我转移和调节机制相关。ICEVpaTF2也包含5个外源基因插入的热点区(HS)、2个可变区(VR)以及3个非典型插入位点。HS和VR包含了大量可变基因,它们负责编码限制性修饰系统、DNA修复系统或毒素-抗毒素系统等,赋予宿主广泛适应性功能,ICEVpaTF2也包含独特未知功能基因。通过对int、xis二个核心保守基因种系发生分析,发现ICEVpaTF2的int、xis分别属于以R391和SXT为代表的亚群。ICEVpaTF2在attL和attR处发生剪切并完成环化,新形成杂合重组的attB和attP位点。【结论】ICEVpaTF2属于SXT/R391家族,是一个具备自我剪切和环化能力的完整ICE元件,剪切后新形成的attB和attP位点由attL、attR杂合重组形成。