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美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量:1
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作者 孔文迪 陈曦 +1 位作者 杨金先 葛均青 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期358-365,共8页
为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出... 为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。 展开更多
关键词 美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV) 普通pcr 荧光定量pcr sybr green 检测方法
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3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用
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作者 汤文菲 罗宇航 +12 位作者 董覃婷 朱鑫玥 王杨林 韦祖樟 陈樱 欧阳康 覃一峰 钟舒红 谢江 陈集成 王小玲 黄伟坚 潘艳 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期819-824,共6页
哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性... 哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 哺乳动物正呼肠孤病毒 sybr green i 荧光定量pcr 病毒检测
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三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 赵丹阳 施慧 +2 位作者 许文军 何杰 王庚申 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1273-1281,共9页
为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对... 为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPCR方法阈值循环数(cycle threshold value,Ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;Ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PCR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。 展开更多
关键词 十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1 DiV1) 荧光定量pcr sybr green 检测方法
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水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用
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作者 汪宏才 商雨 +7 位作者 马瑶 曾哲 张蓉蓉 姚伦 罗玲 李丽 温国元 罗青平 《湖北农业科学》 2024年第6期218-222,共5页
为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.... 为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。 展开更多
关键词 水禽细小病毒 检测方法 sybr green 荧光定量pcr
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鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 陈佳圣 赵天琪 +3 位作者 刘东华 孙祥茹 陈文德 李根 《中国家禽》 北大核心 2024年第1期56-61,共6页
为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×... 为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。 展开更多
关键词 鸡圆环病毒 sybr greenⅠ实时荧光定量pcr 检测方法
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致对虾急性肝胰腺坏死病弧菌SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:3
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作者 张明辉 安伟 张海强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1032-1037,共6页
为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并... 为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。 展开更多
关键词 急性肝胰腺坏死病 sybr green i 荧光定量pcr 弧菌
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Determining the Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Plant by SYBR Green Real-time Quantitative PCR
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作者 裘劼人 许颖 喻富根 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2011年第6期829-831,835,共4页
[Objective] To explore the feasibility of using SYBR Green real-time quantitative PCR technique to estimate the copy numbers of exogenous gene in a transgenic plant.[Methods] Using SYBR Green real-time quantitative PC... [Objective] To explore the feasibility of using SYBR Green real-time quantitative PCR technique to estimate the copy numbers of exogenous gene in a transgenic plant.[Methods] Using SYBR Green real-time quantitative PCR technique,we have determined the copy numbers of the exogenous CYCD3;1 in transgenic Arabidopsis by comparing an endogenous single copy reference gene with CYCD3;1 copy numbers in transgenic plant,meanwhile comparing CYCD3;1 copy numbers between wild plant and transgenic plant.[Results]The exogenous CYCD3;1 copy numbers calculated by this method is identical with results of traditional Southern blot analysis which is highly accurate.[Conclusion]This method is simple,effective and safe for estimating transgene copy numbers. 展开更多
关键词 Transgenic Arabidopsis sybr green real-time quantitative pcr Gene copy number
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华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立
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作者 苑淑贤 侯绪森 +5 位作者 宫鹏涛 郭衍冰 董航 孙兴忠 王楠 曹利利 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第17期7-12,139,140,共8页
为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物,筛选最佳引物浓度和退火温度,绘制标准曲线,优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ... 为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物,筛选最佳引物浓度和退火温度,绘制标准曲线,优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明:最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R^(2))为0.9823。该方法的最低检出限为1×10^(2)copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%~2.59%和0.36%~0.76%,表现出良好的重复性;仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线,具有较好的特异性;与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 华支睾吸虫 囊蚴 CSCOⅠ sybr green 实时荧光定量pcr
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鹅星状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量:14
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作者 白彩霞 张达 +6 位作者 赵靓 杨侃侃 王小朋 李新路 李锦春 李永东 王勇 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期634-638,共5页
为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、... 为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 sybr green i荧光定量RT-pcr 检测
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基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌 被引量:7
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作者 于永翔 王印庚 +5 位作者 刘智超 廖梅杰 张正 荣小军 李彬 战文斌 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2014年第3期134-142,共9页
灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR... 灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。 展开更多
关键词 gyrB基因 灿烂弧菌 实时定量pcr sybr green i
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牛病毒性腹泻病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:6
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作者 韩猛立 黄新 +1 位作者 钟发刚 唐思静 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期333-339,共7页
[目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区(5′ UTR)核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[... [目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区(5′ UTR)核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[结果]建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102~108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102 copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5%,具有重复性好的特点.[结果]成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查. 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量RT-pcr sybr green
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牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:4
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作者 韩猛立 杨井泉 +3 位作者 姚守秀 黄新 薄新文 钟发刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期762-767,共6页
为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3... 为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL~1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。 展开更多
关键词 sybr green 实时荧光定量pcr α-干扰素 Β-干扰素 γ-干扰素
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微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫SYBR Green real time PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 李安平 黄克和 +4 位作者 王权 朱志宏 曹积生 巩新民 杨国柱 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期510-515,共6页
根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便... 根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测。结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40)。表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查。 展开更多
关键词 实时荧光定量聚合酶链式反应 sybr green 微小隐孢子虫 安氏隐孢子虫
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猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 李金磊 王亚宾 +4 位作者 崔保安 陈丽颖 张红英 李珂珂 魏战勇 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期313-317,共5页
为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传... 为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测. 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 N基因 sybr-green i 荧光定量pcr
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SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立 被引量:4
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作者 陈海一 迟德富 +3 位作者 姚大彬 刘航 李晓灿 宇佳 《中国农学通报》 CSCD 2013年第12期157-163,共7页
为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反... 为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μmol/L和50ng/μL。最佳PCR反应程序为:94℃预变性30s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30s,72℃延伸40s,最后加做熔解曲线82℃1s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。 展开更多
关键词 洋虫 Β-ACTiN基因 荧光定量RT-pcr sybr green
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猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制 被引量:4
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作者 余波 周思旋 +3 位作者 谭诗文 徐景峨 史开志 杨莉 《湖北农业科学》 2015年第1期126-129,133,共5页
根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,... 根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2基因 sybr green i荧光定量
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SYBR Green I联合TaqMan荧光定量PCR检测HBV-DNA的意义 被引量:2
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作者 赵友云 高应林 +1 位作者 王春香 乐惠荣 《热带医学杂志》 CAS 2007年第6期575-577,共3页
目的探索SYBR GreenI联合TaqMan荧光定量PCR检测HBV-DNA的意义。方法选择浓度为108.48、105.70和103.70copies/ml的3种HBV-DNA阳性血清和<1×103.0copies/ml的阴性血清各1份,在TaqMan-PCR混合反应体系中加入SYBR Green I组成双荧... 目的探索SYBR GreenI联合TaqMan荧光定量PCR检测HBV-DNA的意义。方法选择浓度为108.48、105.70和103.70copies/ml的3种HBV-DNA阳性血清和<1×103.0copies/ml的阴性血清各1份,在TaqMan-PCR混合反应体系中加入SYBR Green I组成双荧光PCR(TaqMan+SYBR Green I组),同时进行TaqMan和SYBR Green I的单荧光PCR(分别为TaqMan组和SYBR Green I组),设置同一PCR和熔解曲线的循环参数,检测HBV-DNA含量及其Tm,每种方法一次检测每份血清5次。结果TaqMan+SYBR Green I组检测的HBV-DNA阳性血清均为阳性,其平均含量为108.55±、105.79±、103.81±,与TaqMan组的108.49±、105.69±、103.72±copies/ml0.320.290.300.310.300.25对应浓度值取10对数比较,无统计学意义(t=0.31、0.54和0.27,P>0.05);与SYBR Green I组的108.41±、0.35105.21±和103.26±copies/ml(不含未检出的两次血清)比较,除高浓度外,中低浓度有统计学意义(t=2.90和0.340.262.62,P<0.05)。TaqMan+SYBR Green I组和SYBR Green I组阳性血清均出现明显熔解曲线,熔解温度(Tm)分别为71.8℃、72℃和79.8℃,阴性血清未出现扩增曲线和Tm值。结论SYBR Green I联合TaqMan-PCR检测HBV-DNA时,具有能维持TaqMan-PCR的高灵敏度、特异性更强,并能同时检测HBV-DNATm的特点,为HBV的DNA多态性分析,尤其是在HBV基因分型方面提供了新的检测思路。 展开更多
关键词 sybr green TAQMAN 探针 定量pcr HBV-DNA含量 Tm
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SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义 被引量:3
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作者 刘琴 王伟 张仙珍 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期422-425,共4页
目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者2... 目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率(ESR)检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为(2.42±0.75),显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34),差异均有统计学意义(P均〈0.05);miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.914(95%CI:0.872~0.926);以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为(37.5±5.2)mm/h,缓解期RA组为(14.4±4.7)mm/h,OA组为(11.6±5.1)mm/h,健康对照组为(9.6±3.9)mm/h,各组间差异有统计学意义(F=177.01,P〈0.01)。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。 展开更多
关键词 sybr greenⅠ实时荧光定量pcr 微小RNA-146a 类风湿关节炎
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SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结直肠癌中Tiam-1和HPA-1基因的表达 被引量:2
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作者 崔京远 马红 +2 位作者 马文慧 王贺 周东风 《中国现代普通外科进展》 CAS 2010年第7期509-513,共5页
目的:检测Tiam-1基因和HPA-1基因在结直肠癌组织中的表达水平,探讨两者与结直肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:选取2009年8月-2010年1月我院行手术治疗的结直肠癌患者53例。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方... 目的:检测Tiam-1基因和HPA-1基因在结直肠癌组织中的表达水平,探讨两者与结直肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:选取2009年8月-2010年1月我院行手术治疗的结直肠癌患者53例。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Tiam-1 mRNA及HPA-1 mRNA在结直肠癌组织、癌旁组织(距癌2cm)及远离结直肠癌的手术切缘正常组织中(距癌5cm以上)的表达水平,并分析两者与结直肠癌临床病理参数的关系。结果:HPA-1 mRNA和Tiam-1 mRNA在结直肠癌中的表达水平(35.87±12.30,40.79±9.32)显著高于癌旁组织(13.13±6.71,12.39±5.38)和正常组织(4.06±3.55,6.09±4.86,P均<0.05),癌旁组织中二者的表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Tiam-1和HPA-1的基因表达水平在肿瘤的高/中分化和低分化之间,T1~T2和T3~T4之间,有淋巴结转移和无淋巴结转移之间、有血行转移和无血行转移之间及Ⅰ~Ⅱ和Ⅲ~Ⅳ期之间的差异均有统计学意义(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Tiam-1与HPA-1的表达呈正相关趋势(OR=0.46,P=0.048)。结论:Tiam-1 mRNA和HPA-1 mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且二者的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移,联合检测Syndecan-1及HPA-1对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。 展开更多
关键词 结直肠肿瘤 侵袭转移 预后 TiAM-1 HPA-1 sybr greenⅠ实时荧光定量pcr
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SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量
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作者 张捷 李献 +4 位作者 张瑞 刘雨蒙 明若阳 陈佳 周巍 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第16期31-38,共8页
目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性... 目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。 展开更多
关键词 霉菌 酵母 sybr greenⅠ染料 检测 实时荧光定量聚合酶链式反应 发酵乳
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