弓形虫SYBR-Green1荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立SYBR-Green1荧光定量PCR检测弓形虫的方法,并进行实验室方法学评价。方法常规PCR扩增弓形虫RH株高度保守的B1基因部分序列,经TA克隆后转化入大肠埃希菌JM109中。提取重组质粒,PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green1荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验,对桂弓、B36虫株及恶性疟原虫、血吸虫基因组DNA、30份孕产妇标本1、221份无偿献血者标本进行检测。结果用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数0.997,平均试验间变异系数0.81%,检测桂弓、B36虫株均为阳性,而检测血吸虫、恶性疟原虫基因组DNA均为阴性;孕产妇检测阳性率16.7%,平均拷贝数为1.19×105cop-ies/μl;无偿献血者阳性率为0.74%,平均拷贝数为1.17×105copies/μl。结论成功建立了检测弓形虫B1基因的SYBR-Green1荧光定量PCR方法,较常规PCR技术更快捷、敏感、准确,适合临床实验室及无偿献血者的筛查使用。