水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。

三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPCR方法阈值循环数(cycle threshold value,Ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;Ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PCR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

新型阿卡斑病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

【目的】建立检测新型阿卡斑病毒(AKAV)的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测2019年6-10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR最佳反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μL,上、下游引物(4μmol/L)各1.0μL,标准品或反转录产物2.0μL,双蒸水补齐至20.0μL。扩增程序:95℃预变性30 s;95℃30 s,64℃(S基因)/66℃(M基因)30 s,72℃30 s,进行40个循环。SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的极限为1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数(CV)均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。

PCV4 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型(PCV4)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×10~2~5.64×10~9 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R^2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×10~2 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。

华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物,筛选最佳引物浓度和退火温度,绘制标准曲线,优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明:最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R^(2))为0.9823。该方法的最低检出限为1×10^(2)copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%~2.59%和0.36%~0.76%,表现出良好的重复性;仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线,具有较好的特异性;与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。

Determining the Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Plant by SYBR Green Real-time Quantitative PCR

[Objective] To explore the feasibility of using SYBR Green real-time quantitative PCR technique to estimate the copy numbers of exogenous gene in a transgenic plant.[Methods] Using SYBR Green real-time quantitative PCR technique,we have determined the copy numbers of the exogenous CYCD3;1 in transgenic Arabidopsis by comparing an endogenous single copy reference gene with CYCD3;1 copy numbers in transgenic plant,meanwhile comparing CYCD3;1 copy numbers between wild plant and transgenic plant.[Results]The exogenous CYCD3;1 copy numbers calculated by this method is identical with results of traditional Southern blot analysis which is highly accurate.[Conclusion]This method is simple,effective and safe for estimating transgene copy numbers.

新型鸭细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究以新型鸭细小病毒VP3基因保守区域克隆至pMD19-T载体上获得的阳性质粒作为标准阳性质粒,建立一种检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示:在5.17×10^1~5.17×10^7拷贝数呈良好的线性关系,相关系数R^2为0.999、斜率为3.595,灵敏度可达到5.17拷贝数;该方法用于检测鸭常见传染病呼肠孤(DRV)、禽流感(AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭病毒性肝炎(DHV)、鸭星状病毒(DAstV)无非特异性扩增,特异性良好;对安徽、山东、江苏等地鸭场采集的疑似病料进行初步检测,发现48份样品中阳性率达70.8%,与普通PCR方法检测结果相比,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法更灵敏。本研究成功建立了一种检测新型鸭细小病毒SYBR GreenⅠ荧光定量方法,为新型鸭细小病毒的监测奠定了坚实基础。

鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究针对病毒基因组5'端非编码区的保守区域设计引物,建立了用于检测鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型(Gyv3)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。该方法具有较好的特异性,敏感性和重复性,对于鸡Gyv3以外的其他常见鸡病毒性病原的DNA或cDNA均无特异性扩增,灵敏度能达到30.76 copies/μL,组内和组间变异系数均不超过2%。对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR方法对鸡Gyv3检出率为12.28%。

猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验证分析。结果显示:该检测方法在标准品浓度为6.26×10^(1)~6.26×10^(8)copies/μL范围内呈良好线性关系,其相关性为0.999,斜率为-4.312;灵敏度良好,检测下限可达6.26×10^(1)copies/μL;特异性良好,对PEDV和TGEV两种猪常见病原均无特异性扩增;重复性好,组内和组间变异系数均小于2.0%;利用该方法对43份临床样品进行检测,PDCoV阳性率为4.6%。结果表明,本研究成功建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为PDCoV快速灵敏的诊断奠定了坚实基础。

鸡Caspase-1基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10^(3)拷贝/μL~1.0×10^(8)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10^(2)拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%~4.41%和0.37%~0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。

基于核酸适配体-SYBR GreenⅠ快速检测金刚烷胺的荧光传感技术

基于核酸适配体技术,利用SYBR Green Ⅰ荧光染料为信号指示分子,构建了无标记快速检测金刚烷胺的荧光传感技术,可实现对动物源食品中金刚烷胺残留的痕量检测。通过适配体与金刚烷胺之间的特异性识别作用,分析适配体-SYBR Green Ⅰ染料在结合金刚烷胺前后荧光强度的变化来实现对金刚烷胺的定量检测。结果表明,该检测方法在1~100 ng/mL具有良好的线性关系(R^(2)=0.992 5),检测限为0.84 ng/mL。将该方法应用于牛奶样品的检测,回收率为93.22%~104.86%,表现出较好的实用性。该方法操作简便,灵敏性高,特异性强,为食品中兽药残留的检测提供了新的思路。

寨卡病毒SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的建立及应用

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。

基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用

根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10^4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10^2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。

猪源MHC Ⅱ类分子反式激活因子CIITA SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

Class Ⅱ Transactivator(CIITA)作为重要的MHCⅡ类分子反式激活因子在抗原递呈细胞的成熟和功能实现过程中发挥关键作用,为建立一种快速检测猪源CIITA基因的方法,本研究根据GenBank中猪源CIITA基因序列设计引物,从猪肺泡巨噬细胞的总cDNA中扩增CIITA基因,并克隆到pCold-TF载体中获得重组质粒pCold-TF-CIITA。利用重组质粒pCold-TF-CIITA作为标准品建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。试验结果显示:该方法在1.68×10^(1)~1.68×10^(7) copies/μL范围内呈现出良好的线性关系,检测灵敏度可达16.8 copies/μL,组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对不同细胞中的CIITA基因进行检测,结果显示该方法仅能够检测到猪源细胞中的CIITA基因。本试验结果表明,利用pCold-TF-CIITA作为标准品建立的CIITA基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于CIITA基因的定量检测。