为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38....为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。展开更多
为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。...为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。展开更多
为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并...为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。展开更多
金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立...金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.展开更多
目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏...目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏度和重复性。用该方法对20份内镜活检胃组织石蜡标本进行检测,同时作免疫组织化学染色分析。阳性扩增产物以Sanger测序法明确克拉霉素基因突变情况。结果:本研究qPCR方法具备良好特异度和灵敏度,最低可检测2.3×10^(2)copies·μL^(-1)的质粒脱氧核糖核酸(DNA)。标准曲线表明其具有良好线性关系,直线方程为y=–3.6106x+44.626,R2为0.9879>0.98。不同浓度标准品的批内变异系数为0.20%~2.19%,批间变异系数为1.24%~2.63%,均<3%,表明该方法的稳定性和重复性良好。针对20份疑似感染Hp的内镜活检胃黏膜组织石蜡标本,该方法检出Hp阳性样品14份,阳性检出率为70%,免疫组织化学染色方法检出Hp阳性样品15份,阳性检出率为75%,二者的符合率为93.33%。阳性扩增产物经Sanger测序法测序显示均为Hp 23S rRNA基因片段,且14例样品中有5例存在克拉霉素耐药基因突变。结论:本研究建立的SYBR Green qPCR方法的特异度、灵敏度和重复性良好,后续阳性扩增产物的测序结果可明确克拉霉素耐药基因突变情况,适用于临床Hp感染和克拉霉素耐药性的检测。展开更多
BACKGROUND Advancements in laparoscopic technology and a deeper understanding of intra-hepatic anatomy have led to the establishment of more precise laparoscopic hepatectomy(LH)techniques.The indocyanine green(ICG)flu...BACKGROUND Advancements in laparoscopic technology and a deeper understanding of intra-hepatic anatomy have led to the establishment of more precise laparoscopic hepatectomy(LH)techniques.The indocyanine green(ICG)fluorescence navi-gation technique has emerged as the most effective method for identifying hepatic regions,potentially overcoming the limitations of LH.While laparoscopic left hemihepatectomy(LLH)is a standardized procedure,there is a need for innova-tive strategies to enhance its outcomes.important anatomical markers,surgical skills,and ICG staining methods.METHODS Thirty-seven patients who underwent ICG fluorescence-guided LLH at Qujing Second People's Hospital between January 2019 and February 2022 were retrospectively analyzed.The cranial-dorsal approach was performed which involves dissecting the left hepatic vein cephalad,isolating the Arantius ligament,exposing the middle hepatic vein,and dissecting the parenchyma from the dorsal to the foot in order to complete the anatomical LLH.The surgical methods,as well as intra-and post-surgical data,were recorded and analyzed.Our hospital’s Medical Ethics Committee approved this study(Ethical review:2022-019-01).RESULTS Intraoperative blood loss during LLH was 335.68±99.869 mL and the rates of transfusion and conversion to laparotomy were 13.5%and 0%,respectively.The overall incidence of complications throughout the follow-up(median of 18 months;range 1-36 months)was 21.6%.No mortality or severe complications(level IV)were reported.CONCLUSION LLH has the potential to become a novel,standardized approach that can effectively,safely,and simply expose the middle hepatic vein and meet the requirements of precision surgery.展开更多
文摘为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。
文摘为了建立一种敏感、特异的致对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的一类弧菌(VpAHPND)的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究根据Gen Bank中该类弧菌(本研究所用的VpAHPND为副溶血弧菌变异株,下同)PirB毒素基因(KU145397),设计q PCR扩增引物,并采用该引物经PCR扩增PirB基因片段,构建重组质粒p MD18-T-PirB并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品进行q PCR扩增,建立标准曲线,并经反应条件优化初步建立了检测该类VpAHPND的SYBR Green I q PCR方法。以白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾虹彩病毒、虾肝肠胞虫及该VpAHPND的基因组DNA为模板,采用本研究建立的SYBR Green I q PCR方法检测,评估该方法的特异性;以8.3×10^(1)拷贝/μL~8.3×10^(8)拷贝/μL的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的SYBR Green I q PCR以及常规PCR检测,比较两种方法的敏感性;以3个不同浓度的质粒标准品作为模板,利用该方法分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。建立的该q PCR方法的标准曲线显示,各浓度的质粒标准品的拷贝数与其Ct值均呈良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.998。特异性试验结果显示,该方法仅能检出VpAHPND,而其他病原均为阴性结果,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为83拷贝/μL,敏感性是水产行业标准常规PCR的1000倍。重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验变异系数分别在0.31%~0.81%和2.05%~4.34%,重复性好。利用该方法对61株虾源弧菌样品检测,结果显示阳性检出率为29.5%(18/61),阴性样品检测率为70.5%(43/61),与行业标准的常规PCR检测方法结果完全一致,二者的阳性符合率为100%,总符合率为100%。本研究建立了一类致对虾VpAHPND的SYBR Green I q PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为AHPND的诊断、监测与流行病学调查提供技术支撑。
文摘金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.
文摘目的:建立一种高效、特异的检测内镜活检胃组织石蜡包埋标本幽门螺杆菌(Hp)实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法。方法:针对Hp 23S核糖体核糖核酸(rRNA)基因设计特异度引物,建立SYBR Green qPCR反应体系,并验证该方法的特异度、灵敏度和重复性。用该方法对20份内镜活检胃组织石蜡标本进行检测,同时作免疫组织化学染色分析。阳性扩增产物以Sanger测序法明确克拉霉素基因突变情况。结果:本研究qPCR方法具备良好特异度和灵敏度,最低可检测2.3×10^(2)copies·μL^(-1)的质粒脱氧核糖核酸(DNA)。标准曲线表明其具有良好线性关系,直线方程为y=–3.6106x+44.626,R2为0.9879>0.98。不同浓度标准品的批内变异系数为0.20%~2.19%,批间变异系数为1.24%~2.63%,均<3%,表明该方法的稳定性和重复性良好。针对20份疑似感染Hp的内镜活检胃黏膜组织石蜡标本,该方法检出Hp阳性样品14份,阳性检出率为70%,免疫组织化学染色方法检出Hp阳性样品15份,阳性检出率为75%,二者的符合率为93.33%。阳性扩增产物经Sanger测序法测序显示均为Hp 23S rRNA基因片段,且14例样品中有5例存在克拉霉素耐药基因突变。结论:本研究建立的SYBR Green qPCR方法的特异度、灵敏度和重复性良好,后续阳性扩增产物的测序结果可明确克拉霉素耐药基因突变情况,适用于临床Hp感染和克拉霉素耐药性的检测。
基金Supported by The High-level Talent Training Support Project of Yunnan Province,No.YNWR-MY-2020-053and the Key Project of the Second People's Hospital of Qujing in 2022,No.2022ynkt04。
文摘BACKGROUND Advancements in laparoscopic technology and a deeper understanding of intra-hepatic anatomy have led to the establishment of more precise laparoscopic hepatectomy(LH)techniques.The indocyanine green(ICG)fluorescence navi-gation technique has emerged as the most effective method for identifying hepatic regions,potentially overcoming the limitations of LH.While laparoscopic left hemihepatectomy(LLH)is a standardized procedure,there is a need for innova-tive strategies to enhance its outcomes.important anatomical markers,surgical skills,and ICG staining methods.METHODS Thirty-seven patients who underwent ICG fluorescence-guided LLH at Qujing Second People's Hospital between January 2019 and February 2022 were retrospectively analyzed.The cranial-dorsal approach was performed which involves dissecting the left hepatic vein cephalad,isolating the Arantius ligament,exposing the middle hepatic vein,and dissecting the parenchyma from the dorsal to the foot in order to complete the anatomical LLH.The surgical methods,as well as intra-and post-surgical data,were recorded and analyzed.Our hospital’s Medical Ethics Committee approved this study(Ethical review:2022-019-01).RESULTS Intraoperative blood loss during LLH was 335.68±99.869 mL and the rates of transfusion and conversion to laparotomy were 13.5%and 0%,respectively.The overall incidence of complications throughout the follow-up(median of 18 months;range 1-36 months)was 21.6%.No mortality or severe complications(level IV)were reported.CONCLUSION LLH has the potential to become a novel,standardized approach that can effectively,safely,and simply expose the middle hepatic vein and meet the requirements of precision surgery.
