高速逆流色谱法分离制备丹酚酸B

采用高速逆流色谱法分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质,制备丹酚酸B化学对照品。分离采用的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5),上相做固定相,下相做流动相,流速为1.7 mL/min,仪器转速850 rpm,进样量80 mg,纯度用HPLC方法测定。结果表明:一次分离可制备63.4 mg丹酚酸B,其纯度为98.6%。该方法操作简单,可作为高纯度丹酚酸B化学对照品的制备分离方法。

丹酚酸B对骨髓间充质干细胞SCF表达的影响

目的研究中药单体丹酚酸B对骨髓间充质干细胞(MSCs)中干细胞因子(stemcell factor,SCF)的影响。方法用贴壁培养法分离、培养和纯化MSCs,取第三代MSCs进行实验。用含不同浓度丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs,ELISA法检测培养24、48、72h的上清中SCF的含量;RT-PCR法检测培养24、48、72h的SCF mRNA的表达。结果膜型和可溶型SCF mRNA均有表达。随着培养时间的增加,0.3μg/ml、3μg/ml、30μg/ml丹酚酸B可明显促进SCF的分泌和SCF mRNA的表达(与空白对照组比较,P<0.05),而0.03μg/ml丹酚酸B组和空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论丹酚酸B可促进MSCs分泌SCF并促进SCF mRNA的表达,提示SCF可能在中药丹参治疗心肌梗死中发挥了重要作用。

高效液相色谱法测定痹祺胶囊中马钱子碱、士的宁和丹酚酸B

建立了同时测定痹祺胶囊中马钱子碱、士的宁和丹酚酸B含量的方法。采用反相高效液相色谱法,色谱柱:Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm,5μm);流动相:V(乙腈)∶V(10mmol/L己烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液,pH2.86)=22∶78;流速:1.0mL/min;检测波长:254nm;柱温:25℃。马钱子碱、士的宁和丹酚酸B的线性范围分别为2.7～32mg/L(r=0.9998)、2.6～31mg/L(r=0.9999)和12.7～151mg/L(r=0.9991);平均加样回收率(n=6)分别为99.3%、95.6%和98.9%;RSD分别为2.30%、3.68%和1.82%。本方法简便快捷,结果准确,可用于痹祺胶囊的质量控制。

丹酚酸B对离体内皮祖细胞黏附、趋化和增殖的影响

[目的]探讨中药单体丹酚酸B对离体内皮祖细胞(EPCs)黏附、趋化和增殖的影响。[方法]密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs,免疫细胞化学法(CD_(34)/CD_(133)/)鉴定。丹酚酸B最佳药物浓度干预的EPCs, DiI染色法,Transewell小室与DAPI染色法和Brdu免疫细胞化学法测定EPCs的黏附、趋化和增殖能力。[结果]丹酚酸B组EPCs的黏附细胞数量为(37.00±3.27),24h和48h趋化的细胞数量分别为(26.32±2.66)和(53.41±3.85),增殖的细胞数量为(41.17±3.43),与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。[结论]丹酚酸B能够有效促进离体内皮祖细胞的黏附、趋化和增殖能力。

丹酚酸B干预内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞向心肌分化早期基因表达的影响

目的探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(EPCs)对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌分化早期基因表达的影响。方法密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs;免疫细胞化学法(CD34/CD133/CD44)分别鉴定两种细胞。结扎大鼠左冠状动脉,制作大鼠AMI模型,42只大鼠随机分为假手术组,模型组,BMSCs组,EPCs+BMSCs组,其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BMSCs混合,在大鼠AMI区周边分五点注射。RT-PCR检测心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA-4表达。结果细胞移植4w后,EPCs+BMSCs组心肌Nkx2.5、GATA-4表达量分别为2.256±0.524和1.567±0.287,与对照组比较差异显著。结论丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSCs的移植上调了BMSCs向心肌分化过程中Nkx2.5、GATA-4基因的表达,对心肌细胞的数量增加有重要影响,从而有可能改善心功能。

丹酚酸B与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究

在0.01 mol.L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中,用循环伏安法和方波伏安法研究了丹酚酸B与牛血清白蛋白相互作用前后在DNA修饰玻碳电极上的电化学行为。实验表明,丹酚酸B在此修饰电极上于0.100 V处产生良好的氧化峰,加入牛血清白蛋白后,丹酚酸B的电子转移系数α和表观电子传递速率常数ks均发生了变化,氧化峰电位正移,峰电流减小。根据氧化电流的变化求得丹酚酸B和牛血清白蛋白相互作用的结合常数β=1.00×108L.mol-1,结合数m=1.71,表明丹酚酸B与牛血清白蛋白生成了结合比约为2∶1的非电活性复合物。该结果与荧光光谱法的研究结果一致。

丹参酚酸B抑制TLR4-NFκB-TNFα炎症损伤通路防治心肌细胞的缺氧损伤

目的:探讨TLR4-NFκB-TNFα损伤通路和HSP70在体外缺氧培养心肌细胞中的变化规律以及丹参酚酸B的调节作用。方法:分离纯化出生1～3天Wistar乳鼠心肌细胞并复制体外缺氧培养心肌细胞模型。丹参酚酸B(SalB)大、中、小剂量浓度分别为10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1并在缺氧培养前6h进行干预。细胞爬片免疫组化法检测tool样受体4(TLR4)和核因子κB(NFκB)蛋白的表达,ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNFα)和热休克蛋白70(HSP70)的浓度,分光光度计法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:与正常组比较,缺氧培养6h后心肌细胞上清液中MDA、LDH、TNFα含量均显著升高(3.71±0.84)VS(1.78±0.56)(,561.41±129.31)VS(36.80±10.22)(,89.39±21.65)VS(49.42±4.16),P<0.055或P<0.051);心肌细胞TLR4和NFκB蛋白的表达量也显著升高(P<0.055或P<0.051)。与单纯缺氧培养组比较,丹参酚酸B大剂量组MDA含量显著下降(1.94±0.49)VS(3.71±0.84),P<0.051;大、中、小剂量组LDH含量均显著下降(P<0.051);大、中剂量组TNFα含量显著下降(P<0.055);丹参酚酸B大、中、小剂量组NFκB及TLR4蛋白的表达面积或强度均有明显的下降(P<0.055或P<0.051)。结论:TLR4-NFκB-TNFα炎症通路在缺氧培养6h后即明显激活,该通路的激活在缺氧损伤初期(6h内)是不依赖HSP70存在的。丹参酚酸B预防给药对缺氧培养的体外心肌细胞炎症损伤有明显的保护作用。该作用可能与抑制TLR4-NFκB-TNFα炎症通路有关。

HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B的含量

目的:建立HPLC法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸B含量的方法。方法:色谱柱:Kromasil C_(18)柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.6%磷酸溶液梯度洗脱,检测波长:286 nm。结果:原儿茶醛在0.022～0.540μg(r=0.999 3)范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.10%,RSD=1.45%;阿魏酸在0.022～0.550μg(r=0.999 7)范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为99.89%,RSD=1.01%;丹酚酸B在0.206～2.506μg(r=1.000 0)范围内与峰面积呈良好线性关系,平均回收率为101.45%,RSD=1.32%。结论:该方法准确、重复性好,可用于注射用冠心宁的质量控制。

丹酚酸B对缺血再灌注心肌细胞核因子-κB p65核转移与肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的观察丹酚酸B对缺血再灌注损伤心肌细胞核因子-κB p65(NF-κBp65)核转移与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响,评价其对心肌的保护作用。方法新西兰大耳白兔32只随机分为4组:假手术组、缺血再灌注组、丹酚酸B低剂量组和丹酚酸B高剂量组。假手术组(8只):在左冠状动脉前降支0.5cm处穿线不结扎;缺血再灌注组(8只):结扎0.5h后再灌注;丹酚酸B高、低剂量组(各8只):于结扎后分别静滴相应剂量的丹酚酸B溶液,其余各组静滴等量生理盐水。4h后取心肌标本,蛋白质免疫印迹法(West-ern blot)检测NF-κB p65蛋白在心肌细胞核中的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织中TNF-α表达水平,生化法检测心肌髓过氧化物酶(MPO)活性。结果①与假手术组比较,缺血再灌注组NF-κB p65在心肌细胞核中的表达增加(P<0.01),心肌组织中TNF-α表达及MPO活性升高(P<0.01)。②与缺血再灌注组比较,丹酚酸B高、低剂量组NF-κB p65在心肌细胞核中的表达减少、心肌组织中TNF-α表达及MPO活性降低(P<0.05或P<0.01);丹酚酸B高剂量组较低剂量组减少更显著(P<0.01)。结论丹酚酸B可以使心肌缺血再灌注损伤过程中NF-κB p65核转移受到有效抑制,TNF-α表达明显降低,减少中性细胞浸润,从而起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。

葛根素配伍丹酚酸B注射使用对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究葛根素配伍丹酚酸B注射使用对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用。方法:将62只大鼠随机分为假手术组、模型组、葛根素组(20 mg/kg)和葛根素(20 mg/kg)-丹酚酸B不同配比组(质量比分别为1∶0.5、1∶1、1∶2),每组10只。除假手术组外,其余各组大鼠复制MIRI模型。再灌注180 min后,检测大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及心肌梗死面积百分比。结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清中CK、LDH、MDA水平明显升高(P<0.01),SOD水平明显降低(P<0.01);心肌梗死面积百分比明显升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠血清中CK、LDH、MDA水平明显降低(P<0.05或P<0.01),SOD水平明显升高(P<0.05或P<0.01),其中葛根素-丹酚酸B(1∶1)组指标变化最为明显;心肌梗死面积百分比明显降低(P<0.01),其中葛根素-丹酚酸B(1∶1)组和(1∶2)组小鼠的心肌梗死面积小于葛根素注射剂组(P<0.01)。结论:葛根素注射剂配伍丹酚酸B后较单用葛根素注射剂能更有效地抑制MIRI后心肌细胞损伤、减小心肌梗死面积,且以质量比为1∶1时效果最优。

RP-HPLC法测定冠心宁冻干粉针中丹酚酸B含量

目的 测定冠心宁冻干粉针中丹酚酸B的含量，控制冠心宁冻干粉针的质量。方法采用RPHPLC法。色谱柱为Hypersil ODS2 C18柱（250mm×4．6mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-体积分数为1．7％的甲酸水溶液（体积比为15：12：73），检测波长286nm，流速1．0mL·min^-1，柱温30℃，进样量为10止。结果 丹酚酸B质量浓度在1．702-25．53mg·L^-1（r=0．9994，n=6）内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为A=1．05×10^4 ρ=5．21×10^2，平均回收率为99．8％（RSD=2．9％，n=9）。共测定了3批冻干粉针样品，含量质量分数分别为10．7％、9．0％、7．55％，RSD值分别为0．1％、0．1％、0．3％。结论 测定方法灵敏、准确、重复性好，可作为评价冠心宁冻干粉针质量的方法。

高效液相色谱法测定参斛颗粒剂中丹参酮Ⅱ_A与丹酚酸B的含量

目的建立简便迅速的参斛颗粒剂中丹参酮ⅡA与丹酚酸B的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,使用C18柱,分别以甲醇-水(85∶25)和甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相,检测波长:270 nm、286 nm;流速:1mL/min;柱温:室温。结果在此色谱条件下丹参酮ⅡA在含量0.1～0.5μg线性关系良好,平均加样回收率为97.71%,RSD为1.29%;丹酚酸B在含量0.56～2.8μg线性关系良好,平均加样回收率为为97.52%,RSD为1.03%。结论高效液相色谱法简便、高效、精确,可作为参斛颗粒剂中丹参酮ⅡA与丹酚酸B的质量控制标准。

反相高效液相色谱梯度洗脱法测定安神补心片中丹参酮Ⅱ_A和丹酚酸B含量

目的测定安神补心片中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量。方法采用Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),梯度洗脱,流动相A为乙腈、B为水、C为甲醇、柱温35℃,检测波长为270 nm。结果丹参酮ⅡA进样量在0.013 21～0.264 2μg范围内,丹酚酸B进样量在0.061 10～1.222 0μg范围内与峰面积均有较好的线性关系,加样回收率丹参酮ⅡA为98.60%,丹酚酸B为98.58%。结论该方法结果准确、快速,可作为安神补心片中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量测定方法。

消栓通络片中丹酚酸B的鉴别研究

目的:初步探索消栓通络片中丹酚酸B的鉴别方法。方法:采用HPLC法,以Wonda Cract ODS-2(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱、乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相,进行梯度洗脱;检测波长为286 nm;柱温为30℃;流速为1.0 mL·min^(-1),进样量为10μL。结果:4批样品中仅有一批样品检出丹酚酸B的色谱峰,并且与丹酚酸B对照品的光谱图一致。结论:该方法简单易行,专属性高,为消栓通络片质量标准的完善提供实验依据。

碱性成纤维细胞生长因子与丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）与丹酚酸B（SalB）联合对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）定向分化为心肌样细胞的影响。方法：取SD大鼠四肢骨骨髓，分离培养并鉴定BMSCs，对第2代BMSCs作定向诱导，根据加入诱导剂的不同分为bFbF组、丹酚酸B组、两者联合组及对照组（不加任何诱导剂）。相差显微镜观察培养细胞的形态学变化；各组培养4周后，应用免疫细胞化学检测结蛋白（desmin）、a-横纹肌肌动蛋白（（x-sarcomericactin）、原肌球蛋白（tropomyosin）及肌钙蛋白T（cTnT）的表达情况；透射电镜观察分化细胞的超微结构变化。结果：对照组细胞结蛋白、a-横纹肌肌动蛋白、原肌球蛋白及肌钙蛋白T均为弱阳性或阴性表达。与对照组相比，bFGF组、丹酚酸B组及两者联合诱导组BMSCs以上各标记物的阳性表达均明显升高，差异具有统计学意义。其中，两者联合诱导组各标记物的阳性率均显著高于bF（订或丹酚酸B单独诱导组。透射电镜结果显示，bFGF组、丹酚酸B组及两者联合诱导组分化的细胞多呈杆状，胞核卵圆形，位于细胞中央，胞质中可见平行排列的肌丝、大量粗面内质网和线粒体，并富含糖原和核糖体。结论．bFGF、丹酚酸B均可分别及联合诱导BMSCs获得心肌分化表型，且两者联合诱导效果优于单一诱导效果。

丹酚酸B和高氧液对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响

目的探讨高氧液和丹酚酸B对肢体缺血再灌注损伤的影响。方法选用健康新西兰家兔24只,随机分为4组,在缺血前从耳缘静脉推注等量的生理盐水(A组)、高氧液(B组)、丹酚酸B(C组)或高氧液加丹酚酸B(D组),夹阻股动静脉,建立肢体缺血再灌注损伤模型,在缺血前和再灌注4h抽血检测LDH、CK,取腓肠肌作LDH酶组织化学染色。结果再灌注4h,血清肌酸激酶活性较前明显升高,高氧液和丹酚酸B可以抑制其升高(P<0.01),两者有协同作用(P=0.05);血清乳酸脱氢酶活性较前明显升高,高氧液和丹酚酸B可以抑制其升高(P<0.01),两者有协同作用(P<0.01)。LDH酶组织化学显色见:相对于对照组其他组组织织LDH酶活性较低,以联合用药组最低。结论高氧液和丹酚酸B对缺血再灌注损伤起预防作用,而且两者有协同作用。

丹酚酸B和高氧液对兔肢体缺血再灌注氧化应激损伤的影响

目的探讨高氧液和丹酚酸B对肢体缺血再灌注损伤的影响。方法选用健康新西兰家兔24只,随机分为4组,在缺血前从耳缘静脉推注等量的生理盐水(A组)、高氧液(B组)、丹酚酸B(C组)或高氧液加丹酚酸B(D组),夹阻股动、静脉,建立肢体缺血再灌注损伤模型,在缺血前和再灌注4h抽血检测MDA、SOD,取腓肠肌作病理检测。结果血清丙二醛浓度较前明显升高,高氧液和丹酚酸B可以抑制其升高(P<0.01),两者有协同作用(P<0.01);血清超氧化物歧化酶活性较前明显降低,高氧液和丹酚酸B可以抑制其降低(P<0.01),两者有协同作用(P<0.01)。骨骼肌HE染色见:相对于对照组其他组骨骼肌损伤程度较轻,以联合用药组最轻。结论高氧液和丹酚酸B能抑制肢体缺血再灌注氧化应激损伤,而且两者有协同作用。

正交试验法优选丹酚酸B提取工艺

目的:探索一种经济、适用、高效的丹酚酸B的醇提工艺。方法:对醇提取过程中涉及到的药材粉碎度、浸泡时间、乙醇浓度、提取温度4个影响因素采用正交实验设计进行分析,确定各因素的影响程度和最佳水平。结果:丹酚酸B的最佳醇提条件为:将药材切成厚片,投料,不经浸泡,用30%乙醇于90℃回流提取效果最佳。结论:该方法提取效率高,重现性好。

HPLC法测定乳康颗粒中丹酚酸B的含量

目的:建立乳康颗粒中丹酚酸B的含量测定方法。方法:采用HPLC法,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;甲醇—乙腈—水—甲酸(22∶10∶68∶2)为流动相;检测波长:286nm。结果:丹酚酸B在0.146～0.730μg之间呈良好的线性关系(r=0.9996),平均加样回收率为99.4%,(RSD=1.0%,n=5)。结论:本法灵敏、准确、重现性好,精密度高、专属性强。可用于乳康颗粒的质量控制。

两种丹酚酸的体外抗氧化活性比较研究

目的比较研究两种重要的丹酚酸化合物(丹酚酸A和丹酚酸B)的体外抗氧化活性。方法利用DPPH自由基清除、超氧阴离子清除、抗脂质过氧化、还原能力以及抑制脱氧核糖降解等体外实验,综合评价抗氧化能力。结果丹酚酸B(SAB)的电子传递和超氧阴离子清除能力强于丹酚酸A(SAA);SAA在DPPH自由基清除、抗脂质过氧化以及抑制脱氧核糖降解方面的活性均强于SAB,特别对于羟自由基定位介导的脱氧核糖降解具有显著的抑制作用,提示其为较强的金属离子络合剂。结论 SAA是一种极具开发价值的天然抗氧剂候选化合物,可能通过自由基清除、抗脂质过氧化、抑制脱氧核糖降解以及金属离子螯合发挥抗氧化作用。