水母雪兔子通气组织形成相关基因SmPAD 4的克隆及表达分析

通气组织是水母雪兔子(Saussurea medusa)应对极端环境的适应性结构,其形成通常伴随着细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)的发生,而细胞的死亡与通气组织的形成通常受到PAD 4基因(Phytoalexin Deficient 4)的调控,但PAD 4如何调控水母雪兔子通气组织形成的机制尚不明确。该研究以水母雪兔子为试验材料,利用同源克隆和RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmPAD 4,对其序列、系统进化、表达和亚细胞定位等进行分析,并采用hi-TAIL PCR技术扩增其启动子,以探讨该基因在环境适应中的功能。结果表明:(1)SmPAD 4基因cDNA全长为2047 bp(GenBank登录号为OR766038),包括1866 bp的开放阅读框,编码621个氨基酸,分子式为C_(3163)H_(4906)N_(848)O_(910)S_(26),该蛋白为碱性亲水性不稳定蛋白。(2)系统进化树分析显示,SmPAD 4与刺苞菜蓟CcPAD4的氨基酸序列相似度最高。(3)扩增出1049 bp的SmPAD 4启动子序列,包含有光响应元件、低氧应答元件、干旱和生长素应答元件等顺式作用元件。(4)实时荧光定量(qRT-PCR)分析显示,SmPAD 4基因在根、茎和叶中均有表达且在叶中的表达量最高;在紫外和低氧胁迫下SmPAD 4基因在叶和茎中表达量均上调,根中表达量下调。(5)亚细胞定位显示,SmPAD 4分布于细胞核、细胞膜和叶绿体。该研究表明,SmPAD 4基因拥有独特的蛋白结构域,并且响应低氧和紫外两种环境胁迫,在通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中具有重要作用,为进一步探究SmPAD 4基因在水母雪兔子适应环境过程中的作用提供了理论依据。

不同理化因子对雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响

在 1 2MS液体培养基上研究了不同理化因子对水母雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响。实验结果表明 :氮源总浓度 (包括NH+4和NO-3)为 30mmol L ;NH+4 NO-3比例为 5∶2 5 ;2 %蔗糖和 3%葡萄糖组合 ;0 . 5mg LGA3和 0 . 5mg LIBA ;pH5 8;18h d的光照 (光强为 35 .0 0lx) ;2 4℃ ;摇床转速为 10 0r min有利于毛状根生长及总黄酮的生物合成。在此培养条件下 ,经过2 1d的培养毛状根生长量达到 12. 8g L(DW) ,总黄酮合成量为 192 .2mg L ,即总黄酮含量占毛状根干重的 15 % ,约为干重野生水母雪莲植株总黄酮含量的 2 5倍。

水母雪莲愈伤组织的多态性及其再分化条件的研究

以水母雪莲 ( Saussurea medusa Maxim.)的幼叶为外植体 ,接种于 MS补加 0 .2～4 .0 mg/ L NAA、0 .2～ 4 .0 mg/ L 6-BA的不同组合的培养基上培养 3周 ,即形成大量的原始愈伤组织 ,其中以 MS+2 .0 mg/ L NAA+0 .2 mg/ L 6-BA培养基上的诱导效果最好 ,诱导率可达1 0 0 % .水母雪莲原始愈伤组织呈多态性 ,经继代培养可分离出白色水状、淡黄绿色致密的和紫红色疏松的 3种愈伤组织 ,它们在分化能力上有明显差异 ,白色和淡黄绿色的愈伤组织均无分化能力 ,紫红色愈伤组织有分化能力 .将紫红色愈伤组织转入 MS补加 0 .5～ 4 .0 mg/ L 6-BA、0 .2～1 .0 mg/ L NAA的培养基上 ,经低温 -4℃和 4℃处理 1 0 d,然后置于 2 5℃下光照培养 ,2周后就能诱导出密集的丛生芽 .不定芽转接到 MS+0 .5～ 1 .0 mg/ L IAA+0 .1 mg/ L 6-BA的培基上 ,经 -4℃低温处理 2周 ,然后在 2 5℃下培养 3周就可生根 .低温处理是水母雪莲愈伤组织再分化的关键条件 .组织细胞学观察表明 ,水母雪莲的器官发生主要为不定芽途径 .

不同理化因子对雪莲培养细胞中黄酮类形成的影响

研究了不同理化因子对水母雪莲（ＳａｕｓｕｒｅａｍｅｄｕｓａＭａｘｉｍ）愈伤组织生长及黄酮类化合物生物合成的影响。结果表明，有利于细胞生长及黄酮形成的合适温度为２５℃。白光对愈伤组织生长无促进作用，但有利于黄酮的形成。培养基中添加１ｍｇ／ＬＮＡＡ和０２ｍｇ／Ｌ的ＫＴ组合对细胞的生长较有促进作用。５％蔗糖和１％葡萄糖的组合有利于细胞的生长和黄酮的形成。用６０Ｃｏγ射线辐照愈伤组织，在剂量为４０００Ｇｙ的条件下，获得一个合成黄酮能力高于原愈伤组织７０％的细胞系。用高效液相和紫外分光光度法，测定离体培养光照条件下干细胞总黄酮的含量为３２％，是暗培养的４４倍。培养温度２５℃时干细胞黄酮的含量为２０２％，分别为２０℃，３５℃时的５倍和３２倍。

野生雪莲和培养雪莲总黄酮主要药效作用比较研究

目的观察野生、培养雪莲总黄酮的镇痛、抗炎以及免疫调节作用。方法采用小鼠热刺激甩尾实验、小鼠耳肿胀法、大鼠角叉菜胶性足跖肿胀实验以及小鼠脾脏T、B淋巴细胞转化实验观察野生、培养雪莲总黄酮的镇痛、抗炎以及免疫调节作用。结果野生、培养雪莲总黄酮对热刺激所致疼痛具有明显的镇痛效果;对小鼠耳肿胀和大鼠足肿胀有明显的抑制作用;对小鼠T、B淋巴细胞转化功能都有明显抑制作用;野生与培养雪莲总黄酮的主要药效作用无显著性差异。结论野生、培养雪莲总黄酮都具有镇痛、抗炎以及免疫抑制作用,二者作用无显著性差异。

光照对水母雪莲愈伤组织合成生物碱的影响

以水母雪莲 (Saussurea medusa Maxin.)无菌幼苗的根作外植体 ,诱导获得的愈伤组织为材料 ,研究光照对生物碱合成的影响。结果表明 :尽管在水母雪莲的愈伤组织培养物中 ,总生物碱的含量比原植株中的含量低 ,但其组成成分比原植物丰富 ,并且秋水仙碱的含量也比原植物高 。

稀土元素对水母雪莲细胞生长及黄酮类化合物合成的影响

研究了稀土元素钕(Nd3+)、铈(Ce3+)、镧(La3+)和混合稀土(MRE)对摇瓶液体培养的水母雪莲细胞生长及黄酮类化合物合成的影响. 发现Ce3+和La3+及混合稀土可促进雪莲细胞的生长及黄酮类化合物的合成,其中以Ce3+效果最佳. 当初始浓度为0.025 mmol/L的Ce3+添加到改良的MS培养基中时,细胞生物量和黄酮类化合物产量最高,分别可达17.7 g/L及942 mg/L,分别是不添加稀土元素的对照实验的134.4%和166.7%;同时发现在培养基中不含外源激素6-BA的条件下,合适浓度的Ce3+可替代6-BA对雪莲细胞生长及黄酮类化合物合成的促进作用,而在培养基中不含NAA时,Ce3+不能替代NAA对雪莲细胞生长及黄酮类化合物合成的促进作用.

藏药雪莲原植物水母雪莲及其混淆种类的ITS序列比较和分子鉴定

目的 比较藏药“雪莲”原植物水母雪莲及其混淆种类的 ITS序列 ,为分子序列鉴定提供参照系统。方法 利用 PCR扩增和 ABI377自动测序。结果 水母雪莲不同居群间的序列相同 ,与其混淆种类之间存在一定的分子序列差异。结论 ITS序列可正确鉴定水母雪莲与其混淆种类。

水母雪莲体细胞胚胎发生及其植株再生

水母雪莲 (Saussurea medusa Maxim.)茎和叶片的切段接种于 MS+2 mg/ L NAA+0 .5mg/ L6- BA的培养基上 ,2 0 d后产生黄褐色的愈伤组织。经过几个月的继代培养 ,愈伤组织仍保持旺盛的增殖能力 ,但部分由黄褐色逐渐变为红色。将红色愈伤组织转到 MS+0 .1mg/ L NAA+0 .2 mg/ L 6- BA+5mg/ L GA3的培养基上 ,30 d后可分化出大量的体细胞胚。体细胞胚成熟后转到 1 / 2 MS+0 .2 mg/ L IAA+0 .5%活性炭的培养基上 ,30 d后可长出 2～4cm的根。带根的小苗经锻炼后移栽到土壤中 ,成活率达 76%。细胞组织学观察表明 ,发育成熟的体细胞胚具有胚根、胚轴和胚芽的完整结构 ,且有独立的维管系统。

水母雪莲悬浮培养细胞生长和黄酮类活性成分合成

在ＭＳ培养基上进行水母雪莲（ＳａｕｓｕｒｅａｍｅｄｕｓａＭａｘｉｍ．）细胞悬浮培养，研究了摇床转速、接种量、培养液初始ｐＨ、碳源等的影响。结果表明，摇床转速为９０～１２０ｒ／ｍｉｎ，接种量为５０～８０ｇＦＷ／Ｌ，培养液初始ｐＨ５．５～６．０，对水母雪莲悬浮培养细胞生长和黄酮合成最有利。碳源以蔗糖最适合，蔗糖浓度则以４０ｇ／Ｌ较好，此时细胞生长量为１８～１９ｇＤＷ／Ｌ，总黄酮合成量可达１４２３．２５ｍｇ／Ｌ。用ＨＰＬＣ检测显示４′，５，７三羟基３′，６二甲氧基黄酮（ｊａｃｅｏｓｉｄｉｎ）和４′，５，７三羟基６甲氧基黄酮（ｈｉｓｐｉｄｕｌｉｎ）的含量分别达到总黄酮含量的２２．１１％和０．１５％。

水母雪莲总黄酮和水母雪莲细胞培养物总黄酮对致炎大鼠血清中炎性因子的影响

目的:通过观察水母雪莲总黄酮、水母雪莲细胞培养物总黄酮对致炎大鼠血清中炎性因子的影响,探讨其抗炎机理。方法:采用角叉菜胶致足肿胀法造成大鼠炎症模型,观察水母雪莲细胞培养物总黄酮(C)和水母雪莲总黄酮(W)对致炎大鼠血清中炎症介质和细胞因子的影响。其中IL-1β用125I标记RIA试剂盒,PGE2含量用3H标记RIA试剂盒测定;NO含量用Griess法测定。结果:水母雪莲总黄酮、水母雪莲细胞培养物总黄酮各剂量组与模型组相比均可明显抑制IL-1β、NO、PGE2的分泌作用,P<0.01或P<0.05,二者组间无显著差异。结论:水母雪莲总黄酮、水母雪莲细胞培养物总黄酮对IL-1β、NO、PGE2的分泌均有抑制作用,二者无显著性差异,其抗炎作用的机理可能与此有关。

培养基及其组成对水母雪莲悬浮培养细胞生长及黄酮形成的影响

8种不同的基本培养基对水母雪莲(Saussureamedusa)细胞生长和黄酮形成的影响不同。实验结果表明,MS培养基较有利于细胞生长和黄酮形成。从MS培养基修饰得到的MG和MP培养基比前者细胞生长量与黄酮产量分别提高32%和70%。碳源、氮源、植物激素对细胞生长及黄酮形成的影响较为明显。用HPLC对细胞培养物中两种有效黄酮(Jaceosidin和Hispidulin)作了定性定量分析。

水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养

利用 2L搅拌式生物反应器进行了水母雪莲 (SaussureamedusaMaxim .)细胞大规模培养。 2 5℃ ,光强低于 5μmol·m-2 ·s-1条件下培养 12d ,生物量为 10 .35gDW·L-1,黄酮产量为 42 8.6mg/L ,达到细胞干重的 4.14%。此外 ,还对培养过程中的糖代谢、溶解氧浓度变化和氧利用速率进行了研究。

喂饲前体提高悬浮培养水母雪莲细胞的黄酮产量

为提高水母雪莲细胞悬浮培养的生物量及次级代谢产物黄酮的含量,在培养基中喂饲肉桂酸、乙酸钠和苯丙氨酸等三种黄酮生物合成前体,考察了它们对水母雪莲细胞TUIP-8悬浮培养的影响。在（17±1）℃环境中悬浮培养TUIP-8水母雪莲细胞,喂饲这三种前体均能显著促进雪莲黄酮的生物合成,并且对细胞的生长抑制效应较小。在接种时喂饲前体,低浓度添加肉桂酸（7.14mg/L）、乙酸钠（3.57mg/L）和苯丙氨酸（3.57mg/L）更有利于提高黄酮产量。培养后期喂饲前体的效果要好于接种时喂饲,其中17.85mg/L的乙酸钠对黄酮合成的促进作用最强,可使黄酮含量从7.8%提高至12.4%,黄酮产量可提高63%。在（25±1）℃环境中悬浮培养TUIP-8水母雪莲细胞,喂饲前体促进雪莲黄酮生物合成的效果不明显,与对照相比黄酮产量只提高5%-10%。反应器培养的雪莲细胞总黄酮含量可下降至8.5%,但在培养后期使用含有28mg/L乙酸钠、60mg/L苯丙氨酸的改进MS培养基,雪莲细胞的黄酮含量可恢复至11%,细胞密度可达到21g（干重）/L。在悬浮培养水母雪莲细胞过程中添加乙酸钠和苯丙氨酸等前体物质可以促进雪莲黄酮的合成。

雪莲对力竭性游泳小鼠行为和免疫功能的影响

目的 探讨雪莲对力竭性游泳小鼠行为和免疫功能的影响。方法 将小鼠进行力竭性游泳 ,以开场试验检测自主性行为、MTT法测定淋巴细胞转化和溶血空斑法测定抗体形成。结果 力竭性游泳对ConA诱导下的淋巴细胞增殖和抗体形成细胞数量有显著的抑制作用 ,力竭性游泳后小鼠活动时间、活动总路程和中区逗留时间均缩短。雪莲可显著对抗力竭性游泳引起的上述改变。结论 雪莲对力竭性游泳小鼠的疲劳现象、抑郁性行为和恐惧行为有改善作用 ,可能与其免疫调节功能有关。

水母雪莲愈伤组织超低温保存条件的初探

初步研究了水母雪莲愈伤组织的直伤温保存方法，结果表明，预培养，保护剂，预处理，冰冻后处理对愈伤组织存活率都有一定影响，水母雪莲愈伤组织预培养基为添加5％二甲基亚砜的MS培养基，优化的冰冻保护剂是15％二甲基亚砜＋15％乙二醇＋30％甘油的0．4mol/L蔗糖液，冰冻保护剂的预处理温度是15℃，时间为10min，解冻温度25－35℃，在25℃水浴中用含1．2mol/L蔗糖的MS溶液反复洗3次，每次10min，用TTC法测定细胞存活率可达58．5％。

水母雪莲愈伤组织培养和黄酮类化合物的形成

8种基本培养基对水母雪莲 (SaussureamedusaMaxim)愈伤组织生长和黄酮类形成影响不同 ,MS培养基较有利于愈伤组织生长和黄酮类形成。碳源、氮源、植物激素对愈伤组织生长和黄酮类形成影响较为显著。从MS培养基修饰得到的M - 13培养基培养的愈伤组织生长量和黄酮类产量比原培养基分别提高 33%和 82 % ,达到 2 1 0 0gDW /L和 1 89g/L。通过TLC和HPLC初步分析和鉴定 ,证明M - 13培养基上培养的愈伤组织能够形成 2种有效黄酮类成分金合欢素 (jaceosidin)和高车前素 (hispidulin) ,其含量分别占黄酮类的 2 2 %～ 2 4%和 0 15 %～0 17% ,这种百分率与MS培养基培养下的

水母雪莲的细胞培养和高产黄酮细胞系的筛选

用水母雪莲（ＳａｕｓｕｒｅａｍｅｄｕｓａＭａｘｉｍ．）的茎和叶片作外植体，在ＭＳ附加０．５ｍｇ／ＬＢＡ、２ｍｇ／ＬＮＡＡ的培养基上诱导愈伤组织，并研究了不同培养基、植物激素、培养温度以及苯丙氨酸对固体培养细胞生长和黄酮形成的影响。结果表明：ＭＳ培养基附加２ｍｇ／ＬＮＡＡ，在２５℃利于细胞生长；苯丙氨酸对细胞生长未见有促进作用，但有利于细胞中黄酮的形成。用目视法直接挑选两种不同次生代谢能力的细胞系：浅黄色系（Ａ系）和红色系（Ｂ系）。用快速灵敏的紫外分光光度和高效液相法，测得离体培养细胞Ａ系中总黄酮的含量为１．９％，ｊａｃｅｏｓｉｄｉｎ的含量为０．４２％，分别是Ｂ系中的２．３倍和３．９倍，是原愈伤组织中的２．６倍和４．２倍。

钙、磷、镁和钾对雪莲细胞悬浮培养的影响

考察了钙、磷、镁和钾等大量营养元素对雪莲细胞TUIP-8悬浮培养的影响,确定了培养雪莲细胞的钙、磷、镁、钾的最佳浓度范围。低于以上4种大量营养元素的最适浓度范围,TUIP-8细胞的生长和黄酮合成都将明显受到抑制。该细胞对Ca2+和Mg2+具有较好的浓度耐受性,而对PO43-和K+的耐受性较差。

雪莲细胞培养物对大鼠血液流变学的影响

目的：探讨水母雪莲细胞培养物对大鼠血液流变学的影响。方法：将50只雄性SD大鼠均分为5组：对照组（A组）、模型组（B组）、低剂量组（C组）和中剂量组（D组）和高剂量组（E组）。A组给予生理盐水,C组、D组、E组分别给予水母雪莲细胞培养物0.25g/kg、0.5g/kg、1g/kg。第7 d皮下注射肾上腺素,次日采血测定全血粘度和红细胞功能指标。结果：给予水母雪莲细胞培养物的大鼠的观察指标好于模型组,尤以高剂量显著（P〈0.05-〈0.001）。结论：水母雪莲细胞培养物具有改善大鼠血循环的作用。