抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体的构建及其对虫体的杀灭作用

目的构建抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体并测定表达产物对隐孢子虫的杀灭作用。方法利用基因工程原理,以含抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素的菌株为模板,利用设计合成的一对引物扩增出ScFv-PE,利用pMAL-p2X载体构建重组毒素pMAL-ScFv-PE,并将其导入大肠杆菌中进行表达,产物进行SDS-PAGE和Western-blot,纯化后治疗感染隐孢子虫的小鼠。结果重组质粒经酶切鉴定正确,IPTG诱导后可看到明显的条带。凝胶薄层扫描分析目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的21%。纯化后的表达产物治疗感染隐孢子虫的小鼠治疗组比对照组肠滞留物中卵囊计数(P<0.05)与肠道平均累计感染积分明显减少(P<0.01)。结论利用原核表达载体成功构建了可溶性形式表达的pMAL-ScFv-PE重组质粒,重组毒素对隐孢子虫具有明显的杀灭作用。

猪囊尾蚴头节单链抗体-PE40重组蛋白的表达及抗虫活性分析

将含有抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因(ScFv)和绿脓杆菌外毒素基因(PE40)的重组质粒pET28-ScFv-PE40转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,表达产物通过SDS-PAGE和western blot鉴定,其表达蛋白的相对分子量约为68ku,表达量约占菌体总蛋白的13.8%。将融合蛋白通过金属Ni2+亲和层析柱纯化后,目的蛋白纯度在95%以上,可溶性蛋白的回收率约为50%,回收量为5mg/L。本研究所进行的纯化重组蛋白的体外杀伤六钩蚴试验表明,重组蛋白对六钩蚴具有较强的杀灭作用,而且与其剂量呈正相关性。