抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

猪囊尾蚴头节单链抗体-PE40重组蛋白的表达及抗虫活性分析

将含有抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因(ScFv)和绿脓杆菌外毒素基因(PE40)的重组质粒pET28-ScFv-PE40转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,表达产物通过SDS-PAGE和western blot鉴定,其表达蛋白的相对分子量约为68ku,表达量约占菌体总蛋白的13.8%。将融合蛋白通过金属Ni2+亲和层析柱纯化后,目的蛋白纯度在95%以上,可溶性蛋白的回收率约为50%,回收量为5mg/L。本研究所进行的纯化重组蛋白的体外杀伤六钩蚴试验表明,重组蛋白对六钩蚴具有较强的杀灭作用,而且与其剂量呈正相关性。

堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建

用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。

抗人乳腺癌单链抗体重组免疫毒素的构建及初步表达

通过基因克隆技术从绿脓杆菌基因组中扩增出其外毒素基因PE40.利用基因重组技术,将PE40与已克隆的抗人乳腺癌单链抗体基因M4G3/ScFv[1]相互连接,构建出完整的抗人乳腺癌重组免疫毒素M4G3/ScFv-PE40融合基因,导入表达载体PET21a进行初步表达,得到重组蛋白M4G3/ScFv-PE40,体外细胞亲和性实验证实其可特异性识别并结合T47D人乳腺癌细胞,为进一步的融合蛋白高效表达及细胞毒实验打下基础,可望为乳腺癌的临床治疗提供一种新的靶向药物.

猪囊尾蚴头节单链抗体-PE40重组载体的构建及表达

从绿脓杆菌ATCC27853菌株中提取基因组,PCR扩增PE40基因,与pMD18-T载体连接并转化感受态大肠杆菌JM109中,构建重组质粒pMD-PE40;经鉴定正确后将PE40基因插入抗猪囊尾蚴头节单链抗体基因重组质粒pMD-ScFv中,构建重组质粒pMD-ScFv-PE40,经酶切、电泳回收目的片段,并亚克隆到表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-ScFv-PE40;鉴定后转化E.coliBL21,IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表明,试验成功构建了重组表达载体pET-ScFv-PE40,目的片段约为1 800 bp;Western blotting证明重组蛋白具有一定的反应原性,为重组免疫毒素的制备及动物保护性试验奠定了基础。